近紅外激光器與SilVIR探測(cè)器助力高級(jí)多色熒光共聚焦成像
激光掃描共聚焦顯微鏡是流行的生物研究工具。它們通常用于同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像，具有良好的色彩分離效果，還能通過增強(qiáng)的層切功能對(duì)生物標(biāo)本內(nèi)部進(jìn)行深層成像。
如今，炙手可熱的激光技術(shù)創(chuàng)新可使此類應(yīng)用受益，并實(shí)現(xiàn)高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)。在這篇文章中，我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級(jí)多色熒光成像提供動(dòng)力。
讓我們先來了解一下多色成像實(shí)驗(yàn)的歷史。多年來，許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色（通常是綠色和紅色光譜）進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
隨著抗體和成像系統(tǒng)的發(fā)展，有了更多的探測(cè)器和更出色的發(fā)射波長(zhǎng)濾色鏡，四色免疫熒光開始流行。最常見的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。
但有兩個(gè)關(guān)鍵因素阻礙了第五或第六個(gè)通道的引入：
1.缺乏光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管
首先，適合共聚焦顯微鏡的光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率（但不能過高）、極低的功率波動(dòng)和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近，在這些波長(zhǎng)范圍內(nèi)也只有少數(shù)近紅外激光二極管可供選擇。
但由于全新激光二極管技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現(xiàn)在提供685nm、730nm和785nm激光二極管，用于高效激發(fā)諸如下表所示的二級(jí)染料。
2.近紅外波長(zhǎng)靈敏度降低的光電倍增管
實(shí)現(xiàn)高效近紅外成像的第二個(gè)挑戰(zhàn)是，許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)探測(cè)器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長(zhǎng)區(qū)域（750nm以上）的典型檢測(cè)波長(zhǎng)下靈敏度下降。
這種近紅外探測(cè)范圍內(nèi)靈敏度降低的情況，對(duì)于在可見光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來說尤其如此。在750nm以上范圍內(nèi)，GaAsP探測(cè)器的靈敏度非常低。
為了克服這一挑戰(zhàn)，我們?cè)贔V4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測(cè)技術(shù)。我們的SilVIR探測(cè)器利用硅光電倍增管(SiPM)，這是一種半導(dǎo)體傳感器，可在400nm到900nm的寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)采集高信噪比的熒光圖像。
得益于這項(xiàng)技術(shù)，我們的FV4000系統(tǒng)可提供多達(dá)6個(gè)通道的SilVIR探測(cè)器，用于多色熒光應(yīng)用。
與我們的X Line高性能物鏡配套使用，F(xiàn)LUOVEW FV4000系統(tǒng)可在400-1000nm范圍內(nèi)提供高質(zhì)量的寬色差校正。SilVIR探測(cè)器和X-Line物鏡的結(jié)合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。
同時(shí)，近紅外成像的效率受到光路系統(tǒng)多方面的影響，物鏡的紅外透過率和檢測(cè)器的檢測(cè)效率毋庸置疑是核心因素，但對(duì)于激光掃描共聚焦系統(tǒng)，掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸，紅外的反射效率對(duì)圖像亮度的影響是指數(shù)級(jí)的，Evident共聚焦系統(tǒng)采用具有銀鍍膜的掃描振鏡，對(duì)比傳統(tǒng)鋁鍍膜，反射效率更高，在紅外波段的反射效率差異尤其明顯，這大大降低了紅外光信號(hào)的損失，保證了最終紅外信號(hào)的高靈敏探測(cè)。
秉承百年科學(xué)探索精神，Evident不斷為生命科學(xué)研究提供創(chuàng)新工具和解決方案，助力探索生命奧秘。想要進(jìn)一步了解FV4000激光共聚焦顯微鏡如何助力您的科學(xué)研究，歡迎隨時(shí)聯(lián)系Evident申請(qǐng)演示，或識(shí)別以下二維碼，了解詳細(xì)的技術(shù)規(guī)格和案例應(yīng)用。
更多精彩內(nèi)容，敬請(qǐng)關(guān)注我們的視頻號(hào)：
如今，炙手可熱的激光技術(shù)創(chuàng)新可使此類應(yīng)用受益，并實(shí)現(xiàn)高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)。在這篇文章中，我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級(jí)多色熒光成像提供動(dòng)力。
在共聚焦顯微鏡檢查中同步采集5個(gè)以上通道
利用FV4000系統(tǒng)克服技術(shù)挑戰(zhàn)
利用FV4000系統(tǒng)克服技術(shù)挑戰(zhàn)
讓我們先來了解一下多色成像實(shí)驗(yàn)的歷史。多年來，許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色（通常是綠色和紅色光譜）進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
隨著抗體和成像系統(tǒng)的發(fā)展，有了更多的探測(cè)器和更出色的發(fā)射波長(zhǎng)濾色鏡，四色免疫熒光開始流行。最常見的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。
但有兩個(gè)關(guān)鍵因素阻礙了第五或第六個(gè)通道的引入：
1.缺乏光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管
首先，適合共聚焦顯微鏡的光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率（但不能過高）、極低的功率波動(dòng)和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近，在這些波長(zhǎng)范圍內(nèi)也只有少數(shù)近紅外激光二極管可供選擇。
但由于全新激光二極管技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現(xiàn)在提供685nm、730nm和785nm激光二極管，用于高效激發(fā)諸如下表所示的二級(jí)染料。
| 激光 | 熒光染料 | λ_Ex (nm) | λ_Em (nm) |
|---|---|---|---|
| LD685 | Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| DyLight 680 | 692 | 712 | |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | |
| iRFP720 | 702 | 720 | |
| LD730 | ATTO 740 | 743 | 763 |
| DiR | 750 | 782 | |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | |
| Cy7 | 753 | 775 | |
| DyLight 755 | 754 | 776 | |
| LD785 | DyLight 800 | 777 | 794 |
| IR Dye 800CW | 778 | 794 | |
| Alexa Fluor 790 | 782 | 805 | |
| Cy7.5 | 790 | 810 |
以上染料以及越來越多的新型熒光團(tuán)使得增加第五和第六個(gè)同步通道進(jìn)行多色成像變得更具吸引力。
2.近紅外波長(zhǎng)靈敏度降低的光電倍增管
實(shí)現(xiàn)高效近紅外成像的第二個(gè)挑戰(zhàn)是，許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)探測(cè)器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長(zhǎng)區(qū)域（750nm以上）的典型檢測(cè)波長(zhǎng)下靈敏度下降。
這種近紅外探測(cè)范圍內(nèi)靈敏度降低的情況，對(duì)于在可見光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來說尤其如此。在750nm以上范圍內(nèi)，GaAsP探測(cè)器的靈敏度非常低。
為了克服這一挑戰(zhàn)，我們?cè)贔V4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測(cè)技術(shù)。我們的SilVIR探測(cè)器利用硅光電倍增管(SiPM)，這是一種半導(dǎo)體傳感器，可在400nm到900nm的寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)采集高信噪比的熒光圖像。
利用近紅外標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)5~6色熒光同步光譜成像
得益于這項(xiàng)技術(shù)，我們的FV4000系統(tǒng)可提供多達(dá)6個(gè)通道的SilVIR探測(cè)器，用于多色熒光應(yīng)用。
與我們的X Line高性能物鏡配套使用，F(xiàn)LUOVEW FV4000系統(tǒng)可在400-1000nm范圍內(nèi)提供高質(zhì)量的寬色差校正。SilVIR探測(cè)器和X-Line物鏡的結(jié)合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。
同時(shí)，近紅外成像的效率受到光路系統(tǒng)多方面的影響，物鏡的紅外透過率和檢測(cè)器的檢測(cè)效率毋庸置疑是核心因素，但對(duì)于激光掃描共聚焦系統(tǒng)，掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸，紅外的反射效率對(duì)圖像亮度的影響是指數(shù)級(jí)的，Evident共聚焦系統(tǒng)采用具有銀鍍膜的掃描振鏡，對(duì)比傳統(tǒng)鋁鍍膜，反射效率更高，在紅外波段的反射效率差異尤其明顯，這大大降低了紅外光信號(hào)的損失，保證了最終紅外信號(hào)的高靈敏探測(cè)。
秉承百年科學(xué)探索精神，Evident不斷為生命科學(xué)研究提供創(chuàng)新工具和解決方案，助力探索生命奧秘。想要進(jìn)一步了解FV4000激光共聚焦顯微鏡如何助力您的科學(xué)研究，歡迎隨時(shí)聯(lián)系Evident申請(qǐng)演示，或識(shí)別以下二維碼，了解詳細(xì)的技術(shù)規(guī)格和案例應(yīng)用。
更多精彩內(nèi)容，敬請(qǐng)關(guān)注我們的視頻號(hào)：
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