ACE-seq助力開發(fā)EDD-5hmC檢測新技術(shù)用于疾病診斷研究中精準(zhǔn)定量
表觀遺傳修飾在多種生物和病理過程中起著關(guān)鍵作用，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的早期分子事件，并已成為一個(gè)非常有前景的生物標(biāo)志物。近年來，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）作為5mC的氧化產(chǎn)物，在正常哺乳動物生長和發(fā)育中也扮演著重要角色，并與癌癥和神經(jīng)疾病等疾病相關(guān)，顯示出作為癌癥診斷理想生物標(biāo)志物的巨大潛力。然而，由于5hmC水平比5mC低約14倍，且其結(jié)構(gòu)與C和5mC相似，使得5hmC的定量檢測更具挑戰(zhàn)性。
近日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院彭小煥博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Analytical Chemistry》期刊發(fā)表題為“Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability”的科研成果，研究建立了一種名為EDD-5hmC的5hmC定量方法，該方法通過結(jié)合酶切（Enzymatic Digestion）和生物脫氨（Deamination）策略，利用qPCR平臺實(shí)現(xiàn)對片段特異性DNA序列中5hmC的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了5hmC水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，結(jié)果顯示單基因Septin9的ROC曲線下面積高達(dá)82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的ROC曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC方法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量5hmC水平的方法。
標(biāo)題：Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability（通過結(jié)合酶切和脫氨作用的qPCR對5hmC片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）
期刊：Analytical Chemistry
日期：2025-1-13
技術(shù)平臺：擴(kuò)增子APOBEC偶聯(lián)DNA羥甲基化測序（ACE-seq）、qPCR等（易基因金牌技術(shù)）
準(zhǔn)確鑒定和定量5hmC有助于闡明其在基因表達(dá)和疾病發(fā)病機(jī)制中的功能，目前的5hmC分析方法在臨床應(yīng)用中，存在假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性DNA序列的5hmC定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性——EDD-5hmC檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的5hmC，然后利用APOBEC（載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽樣）介導(dǎo)的脫氨基作用，有效區(qū)分各種胞嘧啶（C）修飾狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了極高特異性的5hmC定量，使非特異性擴(kuò)增減少8M倍。此外，EDD-5hmC檢測法的非破壞性生物處理過程表現(xiàn)出高靈敏度，最低檢出限(Limit of Detection,LOD)達(dá)到30 aM。研究人員利用該方法首次檢測了結(jié)直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的5hmC水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，單基因Septin9的受試者工作特征曲線下面積高達(dá)82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC檢測法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量5hmC水平的方法。
研究方法
研究中基于ACE-seq分析提出的EDD-5hmC方法包括四個(gè)步驟：
（1）通過T4-β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（T4 BGT）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）反應(yīng)，對5hmC進(jìn)行高效無損傷的葡萄糖基化，生成5ghmC；
（2）應(yīng)用葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶敏感的限制性內(nèi)切酶（GSREs）消化C和5mC，富集完整的5ghmC目標(biāo)；
（3）通過APOBEC脫氨基將C和5mC轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而5ghmC仍被讀作C；
*以上3步驟均為ACE-seq測序的基本原理
（4）使用特異性引物和TaqMan探針結(jié)合并擴(kuò)增5ghmC以產(chǎn)生熒光信號。該方法基于qPCR平臺，通過酶切和脫氨基的雙重作用，有效地區(qū)分5hmC與C和5mC，確保了極高的特異性和靈敏度。
研究結(jié)果
ACE-seq（amplicon APOBEC-coupled epigenetic sequencing）在本研究中用于確定HCT116細(xì)胞中與Septin9和SDC2相關(guān)的5hmC信息，以及EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)。這些信息對于選擇特定的DNA片段進(jìn)行EDD-5hmC分析至關(guān)重要，確保研究中所使用的DNA片段具有高DNA甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（CRC）強(qiáng)相關(guān)。通過ACE-seq獲得的數(shù)據(jù)為EDD-5hmC方法的驗(yàn)證和應(yīng)用提供了準(zhǔn)確的5hmC修飾信息，從而提高研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
重要圖形
（1）AmpACE-seq表征EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)
為了檢驗(yàn)EDD-5hmC檢測法對實(shí)際樣本的可行性，選擇三種模型樣本進(jìn)行驗(yàn)證：未甲基化的HCT116 DKO gDNA（雙敲除）、甲基化的HCT116 gDNA和人類大腦基因組。首先選擇在人類大腦基因組中富含5hmC的表皮生長因子受體（EGFR）基因作為目標(biāo)基因，對選定檢測片段的基因組進(jìn)行CpG島預(yù)測，并通過（amplicon APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測序）AmpACE-seq對EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)進(jìn)行表征。測序結(jié)果顯示，EGFR片段（chr7:55082610−55082724，稱為EGFR gene 68635）在人類大腦基因組中高度富集（平均44.56%），而在未甲基化的HCT116 DKO gDNA和甲基化的HCT116 gDNA中含量較低（平均分別為0.18%和0.66%）。
（2）AmpACE-seq確定HCT116細(xì)胞中目標(biāo)位點(diǎn)對應(yīng)的5hmC信息
通過AmpACE-seq確定了HCT116細(xì)胞中位點(diǎn)對應(yīng)的5hmC信息，最終選定的序列片段為chr17:77373342−77373437、chr8:96494093−96494215和chr8:96494039−96494111，分別命名為Septin9、SDC2 313和SDC2 239，這些片段位于研究團(tuán)隊(duì)先前研究中鑒定的高DNA甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（CRC）強(qiáng)相關(guān)。
圖2：EDD-5hmC檢測法中使用的Septin9（A）、SDC2 313（B）和SDC2 239（C）的最終選定位點(diǎn)。
（3）EDD-5hmC檢測法對Septin9和SDC2的分析性能和臨床診斷性能
為了評估EDD-5hmC檢測法的靈敏度，通過2倍系列稀釋HCT116基因組DNA來評估已建立檢測法的分析性能，其中羥甲基化DNA的理論input拷貝數(shù)通過AmpACE-seq獲得的5hmC比例計(jì)算得出。分析結(jié)果表明，對于Septin9、SDC2 313和SDC2 239，隨著羥甲基化DNA濃度降低，Ct值逐漸增加。羥甲基化拷貝數(shù)與Ct值之間的關(guān)系分別為R²=0.99、R²=0.99和R²=0.95，這突出了EDD-5hmC檢測法的定量分析能力。
使用含有10、10和30個(gè)拷貝/反應(yīng)的Septin9、SDC2 313和SDC2 239羥甲基化DNA的樣本，進(jìn)行了20次重復(fù)檢測，以研究已建立檢測法的LoD。結(jié)果表明在20次重復(fù)反應(yīng)中，Septin9、SDC2 313和SDC2 239呈陽性的概率分別為95%、100%和100%，表明Septin9、SDC2 313和SDC2 239的檢測靈敏度分別約為10、10和30個(gè)拷貝/反應(yīng)，得出的LoD約為30 aM，高于先前報(bào)道113.7 aM靈敏度的5hmC檢測方法。因此，本研究建立優(yōu)化后的EDD-5hmC檢測法表現(xiàn)出高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
易小結(jié)
EDD-5hmC檢測法的建立，能夠在qPCR平臺上以極高的特異性和高靈敏度準(zhǔn)確定量特定片段的5hmC水平。該方法顯著減少了假陽性信號，提高了檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)了約30 aM的最低檢出限（LoD）。同時(shí)，該方法首次證明了檢測單個(gè)基因Septin9中的特定5hmC片段作為CRC的新表觀遺傳生物標(biāo)志物的巨大潛力，其AUC高達(dá)82.8%。未來，通過擴(kuò)展其應(yīng)用到其他疾病和研究更多標(biāo)志物，EDD-5hmC方法可能為與5hmC水平差異相關(guān)的疾病提供有效的臨床檢測和驗(yàn)證研究的新工具。
參考文獻(xiàn)：
Peng X, et al. Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability. Anal Chem. 2025 Jan 13. doi: 10.1021/acs.analchem.4c05147. PubMed PMID: 39804214.
近日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院彭小煥博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Analytical Chemistry》期刊發(fā)表題為“Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability”的科研成果，研究建立了一種名為EDD-5hmC的5hmC定量方法，該方法通過結(jié)合酶切（Enzymatic Digestion）和生物脫氨（Deamination）策略，利用qPCR平臺實(shí)現(xiàn)對片段特異性DNA序列中5hmC的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了5hmC水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，結(jié)果顯示單基因Septin9的ROC曲線下面積高達(dá)82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的ROC曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC方法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量5hmC水平的方法。
標(biāo)題：Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability（通過結(jié)合酶切和脫氨作用的qPCR對5hmC片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）
日期：2025-1-13
技術(shù)平臺：擴(kuò)增子APOBEC偶聯(lián)DNA羥甲基化測序（ACE-seq）、qPCR等（易基因金牌技術(shù)）
準(zhǔn)確鑒定和定量5hmC有助于闡明其在基因表達(dá)和疾病發(fā)病機(jī)制中的功能，目前的5hmC分析方法在臨床應(yīng)用中，存在假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性DNA序列的5hmC定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性——EDD-5hmC檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的5hmC，然后利用APOBEC（載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽樣）介導(dǎo)的脫氨基作用，有效區(qū)分各種胞嘧啶（C）修飾狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了極高特異性的5hmC定量，使非特異性擴(kuò)增減少8M倍。此外，EDD-5hmC檢測法的非破壞性生物處理過程表現(xiàn)出高靈敏度，最低檢出限(Limit of Detection,LOD)達(dá)到30 aM。研究人員利用該方法首次檢測了結(jié)直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的5hmC水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，單基因Septin9的受試者工作特征曲線下面積高達(dá)82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC檢測法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準(zhǔn)確定量5hmC水平的方法。
研究方法
（1）通過T4-β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（T4 BGT）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）反應(yīng)，對5hmC進(jìn)行高效無損傷的葡萄糖基化，生成5ghmC；
（2）應(yīng)用葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶敏感的限制性內(nèi)切酶（GSREs）消化C和5mC，富集完整的5ghmC目標(biāo)；
（3）通過APOBEC脫氨基將C和5mC轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而5ghmC仍被讀作C；
*以上3步驟均為ACE-seq測序的基本原理
（4）使用特異性引物和TaqMan探針結(jié)合并擴(kuò)增5ghmC以產(chǎn)生熒光信號。該方法基于qPCR平臺，通過酶切和脫氨基的雙重作用，有效地區(qū)分5hmC與C和5mC，確保了極高的特異性和靈敏度。
研究結(jié)果
- 特異性和靈敏度：EDD-5hmC方法通過四組不同預(yù)處理的人工合成線性雙鏈DNA（dsDNA）驗(yàn)證了其特異性，結(jié)果顯示該方法能夠顯著減少非特異性擴(kuò)增，將非特異性擴(kuò)增減少了超過八百萬倍，檢測限達(dá)到30 aM。
- 臨床樣本驗(yàn)證：使用未甲基化HCT116 DKO gDNA、甲基化HCT116 gDNA和人腦基因組作為模型樣本，選擇了EGFR基因作為目標(biāo)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，只有經(jīng)過T4 BGT-APOBEC或T4 BGT-MspI-APOBEC聯(lián)合處理的人腦基因組產(chǎn)生了特異性PCR擴(kuò)增。
- 臨床診斷性能：對25例結(jié)直腸癌患者和配對的癌旁組織樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Septin9基因的5hmC水平在CRC組織中顯著高于非腫瘤組織（P < 0.0001），表明Septin9基因的特定片段5hmC水平有潛力作為CRC的診斷標(biāo)志物（AUC = 0.828）。
ACE-seq（amplicon APOBEC-coupled epigenetic sequencing）在本研究中用于確定HCT116細(xì)胞中與Septin9和SDC2相關(guān)的5hmC信息，以及EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)。這些信息對于選擇特定的DNA片段進(jìn)行EDD-5hmC分析至關(guān)重要，確保研究中所使用的DNA片段具有高DNA甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（CRC）強(qiáng)相關(guān)。通過ACE-seq獲得的數(shù)據(jù)為EDD-5hmC方法的驗(yàn)證和應(yīng)用提供了準(zhǔn)確的5hmC修飾信息，從而提高研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
重要圖形
（1）AmpACE-seq表征EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)
為了檢驗(yàn)EDD-5hmC檢測法對實(shí)際樣本的可行性，選擇三種模型樣本進(jìn)行驗(yàn)證：未甲基化的HCT116 DKO gDNA（雙敲除）、甲基化的HCT116 gDNA和人類大腦基因組。首先選擇在人類大腦基因組中富含5hmC的表皮生長因子受體（EGFR）基因作為目標(biāo)基因，對選定檢測片段的基因組進(jìn)行CpG島預(yù)測，并通過（amplicon APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測序）AmpACE-seq對EGFR基因片段的5hmC狀態(tài)進(jìn)行表征。測序結(jié)果顯示，EGFR片段（chr7:55082610−55082724，稱為EGFR gene 68635）在人類大腦基因組中高度富集（平均44.56%），而在未甲基化的HCT116 DKO gDNA和甲基化的HCT116 gDNA中含量較低（平均分別為0.18%和0.66%）。
（2）AmpACE-seq確定HCT116細(xì)胞中目標(biāo)位點(diǎn)對應(yīng)的5hmC信息
通過AmpACE-seq確定了HCT116細(xì)胞中位點(diǎn)對應(yīng)的5hmC信息，最終選定的序列片段為chr17:77373342−77373437、chr8:96494093−96494215和chr8:96494039−96494111，分別命名為Septin9、SDC2 313和SDC2 239，這些片段位于研究團(tuán)隊(duì)先前研究中鑒定的高DNA甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（CRC）強(qiáng)相關(guān)。
圖2：EDD-5hmC檢測法中使用的Septin9（A）、SDC2 313（B）和SDC2 239（C）的最終選定位點(diǎn)。
為了評估EDD-5hmC檢測法的靈敏度，通過2倍系列稀釋HCT116基因組DNA來評估已建立檢測法的分析性能，其中羥甲基化DNA的理論input拷貝數(shù)通過AmpACE-seq獲得的5hmC比例計(jì)算得出。分析結(jié)果表明，對于Septin9、SDC2 313和SDC2 239，隨著羥甲基化DNA濃度降低，Ct值逐漸增加。羥甲基化拷貝數(shù)與Ct值之間的關(guān)系分別為R²=0.99、R²=0.99和R²=0.95，這突出了EDD-5hmC檢測法的定量分析能力。
使用含有10、10和30個(gè)拷貝/反應(yīng)的Septin9、SDC2 313和SDC2 239羥甲基化DNA的樣本，進(jìn)行了20次重復(fù)檢測，以研究已建立檢測法的LoD。結(jié)果表明在20次重復(fù)反應(yīng)中，Septin9、SDC2 313和SDC2 239呈陽性的概率分別為95%、100%和100%，表明Septin9、SDC2 313和SDC2 239的檢測靈敏度分別約為10、10和30個(gè)拷貝/反應(yīng)，得出的LoD約為30 aM，高于先前報(bào)道113.7 aM靈敏度的5hmC檢測方法。因此，本研究建立優(yōu)化后的EDD-5hmC檢測法表現(xiàn)出高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
圖4：EDD-5hmC檢測法對Septin9和SDC2的分析性能。
易小結(jié)
EDD-5hmC檢測法的建立，能夠在qPCR平臺上以極高的特異性和高靈敏度準(zhǔn)確定量特定片段的5hmC水平。該方法顯著減少了假陽性信號，提高了檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)了約30 aM的最低檢出限（LoD）。同時(shí)，該方法首次證明了檢測單個(gè)基因Septin9中的特定5hmC片段作為CRC的新表觀遺傳生物標(biāo)志物的巨大潛力，其AUC高達(dá)82.8%。未來，通過擴(kuò)展其應(yīng)用到其他疾病和研究更多標(biāo)志物，EDD-5hmC方法可能為與5hmC水平差異相關(guān)的疾病提供有效的臨床檢測和驗(yàn)證研究的新工具。
參考文獻(xiàn)：
Peng X, et al. Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability. Anal Chem. 2025 Jan 13. doi: 10.1021/acs.analchem.4c05147. PubMed PMID: 39804214.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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