引言

朊病毒是一類會(huì)引發(fā)人類和動(dòng)物腦部蛋白質(zhì)異常折疊的可傳播病原體。感染會(huì)導(dǎo)致腦損傷，且往往是致命的。此類神經(jīng)退行性疾病的實(shí)例包括羊瘙癢癥、瘋牛病（牛海綿狀腦�。┖涂搜哦�氏病。

以前，研究朊病毒需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的生物測(cè)定，對(duì)受感染的動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間（1-6 個(gè)月）的研究。這種方法既費(fèi)時(shí)，而且飼養(yǎng)感染動(dòng)物的成本也很高。蒙大拿州漢密爾頓的落基山實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)了一種新的朊病毒接種測(cè)定法，稱為實(shí)時(shí)震蕩誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化測(cè)定法（RT-QuIC），可對(duì)受感染樣本中的朊病毒水平進(jìn)行終點(diǎn)定量測(cè)定。與以往的方法相比，這種檢測(cè)方法速度更快，通量更高。該測(cè)定可在短短 20 小時(shí)內(nèi)完成，其靈敏度不亞于甚至高于全動(dòng)物模型。

BMG LABTECH的FLUOstar Omega是唯/一具備長(zhǎng)時(shí)間震蕩和培養(yǎng)微孔板的酶標(biāo)儀，這得益于其堅(jiān)固的“德國制造”結(jié)構(gòu)。RT-QuIC樣本每隔15分鐘測(cè)量一次，共計(jì)20-68小時(shí)，期間交替震蕩1分鐘和靜置1分鐘。我們開發(fā)了一個(gè)軟件腳本，用于控制激活測(cè)定所需的振蕩和靜置時(shí)間。

檢測(cè)原理

RT-QuIC 檢測(cè)法用于估算朊病毒接種的相對(duì)數(shù)量。該檢測(cè)法通過測(cè)量樣本的連續(xù)稀釋，統(tǒng)計(jì)估算接種劑量（SD）。在該檢測(cè)中，極少量的傳染性朊病毒會(huì)被添加到正常的朊病毒蛋白中，從而引發(fā)或?qū)е码貌《镜鞍装l(fā)生類似疾病的錯(cuò)誤折疊。測(cè)定方法是通過測(cè)量樣本的系列稀釋度并確定接種活性損失（SD50），即終點(diǎn)稀釋度來進(jìn)行量化。

實(shí)驗(yàn)步驟

在整個(gè) 20-68 小時(shí)期間，儀器設(shè)置為在 42°C 下恒溫孵育。實(shí)驗(yàn)編寫了兩個(gè)測(cè)試運(yùn)行協(xié)議的腳本。第一個(gè)協(xié)議設(shè)置為振蕩板一分鐘，然后靜置一分鐘；第二個(gè)協(xié)議設(shè)置為每 15 分鐘使用底部光學(xué)鏡進(jìn)行一次熒光終點(diǎn)測(cè)量。熒光染料硫黃素 T（ThT）被用作朊病毒接種標(biāo)記。將 ThT 添加到重組朊病毒蛋白中，當(dāng)發(fā)生聚合反應(yīng)時(shí)，ThT 就會(huì)與朊病毒蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致熒光隨著時(shí)間的推移而增加。

儀器設(shè)置

熒光終點(diǎn) - 底部讀數(shù)

分析

斯皮爾曼-凱伯（Spearman-Kärber）分析法與生物測(cè)定的 50%致死劑量（LD50 ）類似，用于估算每克組織中50%的孔出現(xiàn)硫黃素T（ThT）陽性反應(yīng)的播種劑量或稀釋倍數(shù)（SD50/g）。在進(jìn)行 Spearman-Kärber 分析時(shí)，選擇的稀釋系列中至少有一個(gè)稀釋度的 ThT 陽性率為 100%，以及一個(gè)稀釋度的 ThT 陽性率為 0%。

結(jié)果與討論

使用軟件腳本對(duì)RT-QuIC檢測(cè)進(jìn)行了20至68小時(shí)的測(cè)量，數(shù)據(jù)取自8個(gè)重復(fù)孔的相對(duì)熒光單位平均值。每個(gè)圖表僅顯示每45分鐘的數(shù)據(jù)。

FLUOstar Omega酶標(biāo)儀除了線性振蕩和軌道振蕩外，還能以獨(dú)特的雙軌道振蕩模式進(jìn)行振蕩。在整個(gè)測(cè)量期間，孵育溫度保持在42°C。Omega系列的高品質(zhì)設(shè)計(jì)和堅(jiān)固的制造使研究人員能夠連續(xù)測(cè)量數(shù)天，而不會(huì)中斷振蕩或產(chǎn)生溫度波動(dòng)。數(shù)據(jù)被不間斷地收集并輸出到BMG LABTECH的數(shù)據(jù)分析軟件（MARS）和Excel中。

圖 1 和圖 2 展示了 RT-QuIC 檢測(cè)法與倉鼠豚鼠腦勻漿（BHs）的關(guān)系。圖 1 使用的是接種后 80-85 天（DPI）的倉鼠腦勻漿樣本，而圖 2 使用的是接種后 10 天的倉鼠腦勻漿樣本。

圖 1：RT-QuIC 靈敏度：對(duì) 263K 倉鼠腦勻漿稀釋液的分析。

 
50% 接種劑量（SD50 ）是指在半數(shù)重復(fù)孔中產(chǎn)生足夠增強(qiáng)的 ThT 熒光的量。在本例中，用 10E-9 稀釋的刮傷病 BH 儲(chǔ)存液（深藍(lán)線）的 2 μl 等分試樣（接種量）就能達(dá)到近似的 SD50 。因此，Spearman-Kärber 估計(jì)的 SD50 /2μL 為 10E9.1，SD50 /g 為 10E12。該 SD50 的對(duì)數(shù)（~11）與生物測(cè)定中發(fā)現(xiàn)的 LD50 的對(duì)數(shù)（~10）非常吻合。

圖 2：對(duì)三種 263K 接種臨床前注射后 10 天的倉鼠 BH 進(jìn)行 RT-QuIC 終點(diǎn)稀釋分析。

在此情況下，約50%的播種劑量（SD50）通過2 μl的10E−5稀釋度的瘙癢癥接種后10天263K BH原液（綠色曲線）實(shí)現(xiàn)。其SD50/2μL為10E5.5，SD50/克組織為10E8.2。

正如預(yù)期，接種后85天（DPI）樣本的SD50/克組織（10E12）高于接種后10天的樣本（10E8.2），因?yàn)橛懈�長(zhǎng)的發(fā)病時(shí)間。這些RT-QuIC結(jié)果與生物測(cè)定結(jié)果高度相關(guān)。數(shù)據(jù)表明，RT-QuIC檢測(cè)可視為一種比整動(dòng)物生物測(cè)定更快速、更高通量的替代方法，同時(shí)也表明接種后僅十天的動(dòng)物樣本即可用該方法進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)論
多功能酶標(biāo)儀

使用RT-QuIC檢測(cè)法和酶標(biāo)儀可以更快、更高效地測(cè)量朊病毒接種。一些已證實(shí)可用RT-QuIC檢測(cè)的傳染性海綿狀腦病包括倉鼠和綿羊的癢病、鹿的慢性消耗性疾病、克雅氏�。–JD）和牛海綿狀腦病（BSE）。這種檢測(cè)方法比以往的生物檢測(cè)方法更快、更靈敏。BMG LABTECH的Omega系列酶標(biāo)儀功能強(qiáng)大且堅(jiān)固耐用，能夠承受這種檢測(cè)方法所需的連續(xù)多日高速震動(dòng)。

使用FLUOstar Omega的優(yōu)勢(shì)包括：

• 更快、更高通量的朊病毒接種監(jiān)測(cè)檢測(cè)方法
• 先進(jìn)的酶標(biāo)儀功能，包括震動(dòng)和溫度控制，是檢測(cè)有效性的關(guān)鍵
• 20-68小時(shí)內(nèi)每15分鐘進(jìn)行一次熒光底部讀數(shù)測(cè)量

 
有關(guān)RT-QuIC檢測(cè)的更多詳情，請(qǐng)查看科學(xué)講座“優(yōu)化RT-QuIC檢測(cè)的靈敏度和特異性”。科羅拉多州立大學(xué)的Davin Henderson博士在此分析了使用RT-QuIC檢測(cè)朊病毒時(shí)需要考慮的重要因素。

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