RNA甲基化修飾整體研究方案及其應(yīng)用案例
02.技術(shù)優(yōu)勢(shì)
03. 典型案例
案例1：m5C項(xiàng)目案例：RCMS編輯系統(tǒng)在特定細(xì)胞RNA位點(diǎn)的靶向m5C甲基化和去甲基化研究
期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：IF 16.6
樣本：細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：RNA-BS
本研究作者開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas13d的編輯系統(tǒng)，名為重編程m5C修飾系統(tǒng)（RCMS），用于特定轉(zhuǎn)錄本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。通過m5C RNA-BS等分析揭示RCMS編輯系統(tǒng)能夠精確地在特定RNA位點(diǎn)添加或去除m5C修飾，改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性。
圖：RCMS dCasRx-NSUN6 編輯器的特異性和非靶甲基化測(cè)序[1]
案例2：m6A項(xiàng)目案例：豬骨骼肌發(fā)育和生長(zhǎng)過程中協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后表觀遺傳調(diào)控
期刊：J Anim Sci Biotechnol
影響因子：IF 6.3
樣本：骨骼肌
應(yīng)用技術(shù)：MeRIP-seq、WGBS
對(duì)長(zhǎng)白豬在出生后四個(gè)生長(zhǎng)期（30天、60天、120天和180天）的骨骼肌樣本進(jìn)行全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）和甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq），揭示了5mC和m6A修飾在表觀基因組和表觀轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的相關(guān)動(dòng)態(tài)和共生，這是豬出生后肌生成進(jìn)程中5mC/m6A串?dāng)_的結(jié)果；并鑒定一組在豬出生后骨骼肌生長(zhǎng)中由5mC和m6A修飾共同調(diào)控的肌生成相關(guān)基因。
圖：MeRIP-seq揭示出生后骨骼肌發(fā)育中的m6A表觀轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化[2]
案例3：m5C案例：NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)展中的重要作用
期刊：Clin Transl Med
影響因子：IF 7.9
樣本：癌細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：m5C MeRIP-seq等
本研究通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）細(xì)胞和臨床樣品中的mRNA分離和抗m5C dot blot試驗(yàn)檢測(cè)全局和mRNA m5C水平。建立原位眼內(nèi)異種移植模型以檢查RB的致癌行為，病進(jìn)行全基因組多組學(xué)分析以鑒定NSUN2的功能靶標(biāo)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組篩選和m5C甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（m5C meRIP-seq）。研究結(jié)果表明，NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化在RB的致癌過程中促進(jìn)嘌呤的生物合成。
圖：m5C MeRIP-seq鑒定NSUN2的潛在RNA靶標(biāo)[3]
案例4：m7G案例：mRNA上m7G修飾的識(shí)別蛋白IGF2BP3可促進(jìn)mRNA降解
期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7
樣本：癌細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：MeRIP-seq、RNA-seq等
本研究識(shí)別出IGF2BP蛋白家族，尤其是IGF2BP3，可以優(yōu)先結(jié)合癌細(xì)胞中 mRNA上的內(nèi)部m7G。這一特異性結(jié)合，通過IGF2BP3與外泌體復(fù)合物的EXOSC2相互作用，可以促進(jìn) m7G 修飾的轉(zhuǎn)錄本的降解。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用無催化活性的 dCas13b系統(tǒng)分別與IGF2BP3和METTL1偶合，對(duì)轉(zhuǎn)錄本上特定位點(diǎn)m7G修飾進(jìn)行調(diào)控，從而改變轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。
圖：m5C MeRIP-seq鑒定NSUN2的潛在RNA靶標(biāo)[3]
案例4：m7G案例：mRNA上m7G修飾的識(shí)別蛋白IGF2BP3可促進(jìn)mRNA降解
期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7
樣本：癌細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：MeRIP-seq、RNA-seq等
本研究識(shí)別出IGF2BP蛋白家族，尤其是IGF2BP3，可以優(yōu)先結(jié)合癌細(xì)胞中 mRNA上的內(nèi)部m7G。這一特異性結(jié)合，通過IGF2BP3與外泌體復(fù)合物的EXOSC2相互作用，可以促進(jìn) m7G 修飾的轉(zhuǎn)錄本的降解。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用無催化活性的 dCas13b系統(tǒng)分別與IGF2BP3和METTL1偶合，對(duì)轉(zhuǎn)錄本上特定位點(diǎn)m7G修飾進(jìn)行調(diào)控，從而改變轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。
圖：MeRIP-seq揭示TP53轉(zhuǎn)錄本上存在m7G修飾，受METTL1調(diào)控[4]
案例5：m1A案例：真核生物mRNA中的m1A甲基化動(dòng)態(tài)變化研究
期刊：Nature
影響因子：IF 50.5
樣本：人/小鼠 細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：m1A MeRIP-seq
本研究對(duì)人HeLa（宮頸腺癌），HepG2（肝細(xì)胞癌）和HEK293（胚胎腎）細(xì)胞系（ATCC）和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）（C57BL / 6，ATCC）進(jìn)行基于抗體富集的RNA甲基化免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq），在轉(zhuǎn)錄組范圍定位m1A位點(diǎn)，并將其與Dimroth重排反應(yīng)進(jìn)行耦聯(lián)以獲得高分辨率m1A圖譜。結(jié)果表明m1A在第一個(gè)剪接位點(diǎn)上游起始密碼子周圍富集，m1A傾向于修飾翻譯起始位點(diǎn)周圍一些更結(jié)構(gòu)化的區(qū)域，可以對(duì)生理?xiàng)l件做出動(dòng)態(tài)響應(yīng)，并與蛋白質(zhì)生成呈正相關(guān)。
案例6：acRIP-seq案例：mRNA中胞嘧啶核苷乙酰化可提高翻譯效率
期刊：Cell
影響因子：IF 45.5
樣本：人胚胎腎HEK 293T細(xì)胞
本研究通過對(duì)WT和下調(diào)NAT10的Hela細(xì)胞進(jìn)行acRIP-seq和mRNA-seq，揭示了ac4C在編碼序列中的特異性乙�；瘏^(qū)域富集。NAT10敲除導(dǎo)致在比對(duì)mRNA位點(diǎn)的ac4C檢測(cè)減少，并與靶向mRNA整體下調(diào)相關(guān)。對(duì)mRNA半衰期分析顯示，乙酰化mRNA穩(wěn)定性依賴于NAT10。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，mRNA乙酰化在體內(nèi)外增強(qiáng)底物翻譯。在ac4Cpeaks的密碼子含量分析揭示了在動(dòng)態(tài)位點(diǎn)中胞嘧啶的偏倚表達(dá)，從而影響mRNA解碼效率。
圖：acRIP-seq繪制mRNA ac4C圖譜[6]
案例7：RIP-seq案例：SRSF6調(diào)控可變剪切促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，為結(jié)直腸癌（CRC）治療提供靶點(diǎn)
期刊：Gut
影響因子：IF 23
樣本：CRC組織
本研究通過RIP-seq鑒定SRSF6調(diào)控的可變剪切（AS）及其結(jié)合位點(diǎn)，揭示SRSF6在CRC樣本中上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)，在體外和體內(nèi)促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移。鑒定出SRSF6調(diào)控的AS靶標(biāo)，并揭示SRSF6結(jié)合位點(diǎn)。SRSF6通過直接結(jié)合到其23號(hào)外顯子位點(diǎn)來調(diào)控ZO-1異常剪接，從而作為癌基因發(fā)揮作用。
圖：RIP-seq鑒定SRSF6調(diào)控的RNA結(jié)合motif[7]
04.易基因項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
05.參考文獻(xiàn)
① Zhang T,et al. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res. 2024 Feb 15. pii: 7608824. doi: 10.1093/nar/gkae110. PubMed PMID: 38366553.
② Zhang D, et al. Coordinated transcriptional and post-transcriptional epigenetic regulation during skeletal muscle development and growth in pigs. J Anim Sci Biotechnol. 2022 Dec 1;13(1):146. pii: 10.1186/s40104-022-00791-3. doi: 10.1186/s40104-022-00791-3. PubMed PMID: 36457054.
③ Zuo S, et al. NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273. PubMed PMID: 37228185.
④ Liu C, Dou X, Zhao Y, Zhang L, Zhang L, Dai Q, Liu J, Wu T, Xiao Y, He C. IGF2BP3 promotes mRNA degradation through internal m7G modification. Nat Commun. 2024 Aug 28;15(1):7421. pii: 10.1038/s41467-024-51634-w. doi: 10.1038/s41467-024-51634-w. PubMed PMID: 39198433.
⑤ Dominissini D, et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 2016 Feb 25;530(7591):441-6. pii: nature16998.
⑥ Arango D, et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 2018 Dec 13;175(7):1872-1886.e24. pii: S0092-8674(18)31383-7. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.030. PubMed PMID: 30449621.
⑦ Wan L, et al. SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer. Gut. 2019 Jan;68(1):118-129. pii: gutjnl-2017-314983. doi: 10.1136/gutjnl-2017-314983. PubMed PMID: 29114070.
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