T7共轉錄加帽試劑盒應用與特點
T7共轉錄加帽試劑盒應用：
體外RNA合成
T7共轉錄加帽試劑盒產(chǎn)品特點:
1)一步法化學加帽 一步到位，合成結束，可直接純化
2)嚴格的質量管理規(guī)范 無殘留
3)產(chǎn)生的mRNA活性更高
質量控制：
純度≥95%，宿主DNA殘留≤100pg/mg，宿主蛋白殘留≤50ppm，內毒素殘留≤10EU/mg，無RNA酶、核酸內切酶、核酸外切酶、蛋白酶殘留，無菌，無病原體。
反應體系（僅供參考）：
| 組分 | 體積（uL） | 終濃度 |
| T7 RNA Polymerase Mix | 2 | - |
| 10×Transcription Buffer | 2 | 1× |
| CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) | 2 each | 10 mM each |
| Template DNA | 1 µg | - |
| RNase free H2O | Up to 20 | - |
注意:反應在室溫下進行，由于10×轉錄緩沖液中含有亞精胺，亞精胺濃度過高會導致DNA模板在低溫下沉淀。
備注:
1. 注意不要在反應系統(tǒng)中混入RNase。
2. 實驗設備(如:移液器尖端、產(chǎn)品管等)應嚴格使用RNase Free產(chǎn)品。
3.為了您的安全與健康，請穿白大褂，戴一次性手套。
4. 僅供研究使用!
常見問題解答：
1. 轉錄產(chǎn)量低
模板的質量與成品率密切相關。試驗組的產(chǎn)量顯著低于對照組，可能的原因有:①實驗模板含有抑制成分;模板有問題。
建議:①重新純化模板;②確定模板定量及其完整性;③延長反應時間;④增加模板輸入量;⑤嘗試其他啟動子和RNA聚合酶。
2. 短轉錄產(chǎn)量低
短轉錄起始片段會抑制該反應。當轉錄產(chǎn)物小于100 nt時，延長反應時間至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA產(chǎn)量。
3.RNA轉錄長度大于預期
如果電泳顯示產(chǎn)物條帶大于預期條帶，可能的原因是:①質粒模板可能沒有完全線性化;②感覺鏈3’端結構突出;③RNA具有未完全變性的二級結構。
建議:①檢查模板是否完全線性化，必要時進行額外線性化;②選擇合適的限制性內切酶，避免3'外翻，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成轉錄后再繼續(xù);③用變性凝膠檢測RNA產(chǎn)物。
4. RNA轉錄長度低于預期
如果電泳顯示產(chǎn)物條帶小于預期大小，可能的原因是:①模板中含有類似于T7 RNA聚合酶的終止序列;②模板中GC含量較高。
建議:①降低反應溫度(如30℃)。有時降低溫度可以增加轉錄長度，但會降低產(chǎn)量。或者嘗試不同的RNA聚合酶進行轉錄;②若模板GC含量較高，可采用42℃轉錄，或添加SSB以增加產(chǎn)量和轉錄長度。
5. 轉錄產(chǎn)物的電泳跟蹤
電泳過程中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象�？赡茉�:①實驗操作過程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板。
建議:①使用不含RNase的移液針尖和EP管，佩戴一次性乳膠手套和口罩，所有試劑均使用不含RNase的H2O制備。②重新純化模板DNA。
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