我們比較了在二維聚苯乙烯培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的人類肺癌細(xì)胞與使用BIO X進(jìn)行3D生物打印的肺癌細(xì)胞。在3D細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞重新排列成球狀體，且連接蛋白的分布在二維培養(yǎng)中無法檢測(cè)到。

01 文章
Title:“In Vitro 3D Lung Cancer Model Presents a More Relevant Expression of Junctional Proteins than 2D Cultures”
作者：Josefin Blell, MSc, Shubhankar Nath, PhD,Christen Boyer, PhD, and Itedale Namro Redwan, PhD CELLINK, Gothenburg, Sweden
摘要：肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。為了能夠研究這種復(fù)雜的疾病和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，需要開發(fā)更多與生理相關(guān)的體外模型。本研究將人肺癌細(xì)胞分別在二維聚苯乙烯板和3D生物打印的甲基丙烯酸明膠(GelMA)和Matrigel中培養(yǎng)14天，觀察球形形成、細(xì)胞形態(tài)和連接蛋白。定性分析顯示，與在二維條件下生長的細(xì)胞相比，在三維生物打印模型中，β-連環(huán)蛋白和緊密連接蛋白-1的表達(dá)模式更具生理相關(guān)性。3D生物打印模型中顯示的細(xì)胞重排成球體和連接蛋白的分布在2D培養(yǎng)中無法檢測(cè)到，突出了3D微環(huán)境的重要性。這些結(jié)果表明，3D生物打印有助于建立更相關(guān)的體外疾病模型，并可能使研究人員受益于癌癥研究、分子生理學(xué)和藥物開發(fā)中的自動(dòng)化分析工具。肺的重要功能是向身體交換氣體�？諝鈴臍夤苓M(jìn)入稱為肺泡的最小氣囊，肺泡形成呼吸表面，允許氣體擴(kuò)散(Zscheppang, 2018)。

02 前言
由于進(jìn)入的空氣中含有免疫系統(tǒng)需要對(duì)抗的病毒、污染物和過敏原，免疫系統(tǒng)承受著很大的壓力。肺癌是世界上最常見的癌癥死亡原因(Zscheppang, 2018)。這是一種復(fù)雜的疾病，需要更多的生理相關(guān)模型來理解細(xì)胞異常行為背后的機(jī)制。傳統(tǒng)上，體外癌癥模型是基于二維單層培養(yǎng)的，這有助于研究人員對(duì)癌變機(jī)制有更深入的了解。然而，研究人員開始意識(shí)到使用平面模型研究發(fā)生在生物體中的復(fù)雜疾病的局限性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞嵌入細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中生長，細(xì)胞外基質(zhì)賦予組織機(jī)械特性，促進(jìn)細(xì)胞間通訊(Baker, 2012)。因此，必須開發(fā)仿生肺腫瘤模型，以便更好、更快地測(cè)試潛在的候選藥物。此外，轉(zhuǎn)移和癌癥進(jìn)展的研究對(duì)于更好地了解這種疾病以及如何對(duì)抗它至關(guān)重要。癌細(xì)胞經(jīng)常在三維微環(huán)境中自組裝成多細(xì)胞腫瘤球體。這些成熟的結(jié)構(gòu)允許細(xì)胞和周圍環(huán)境之間的相互作用。在本研究中，研究了生物打印3D構(gòu)建物中肺癌細(xì)胞球形結(jié)構(gòu)的形成，并使用相關(guān)分子標(biāo)記，如β-catenin、CD44和(ZO-1)，與2D培養(yǎng)物進(jìn)行了比較(圖1)。

2.1 E-cadherin/β-catenin復(fù)合物
E-cadherin/β-catenin復(fù)合物在細(xì)胞-細(xì)胞粘附中起關(guān)鍵作用，特別是在上皮細(xì)胞中。具體來說：

2.1.1 E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的功能
E-cadherin：是一種粘附分子，主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的粘附。
β-catenin：與E-cadherin結(jié)合，幫助連接細(xì)胞骨架，從而維持細(xì)胞間的穩(wěn)定聯(lián)系。

2.1.2 復(fù)合物變化對(duì)癌癥的影響
當(dāng)E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞間的粘附會(huì)被抑制。

這種變化可能導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附力減弱，細(xì)胞更容易脫離原有組織，成為游離狀態(tài)。

這種游離的細(xì)胞可能會(huì)獲得侵襲性特征，能夠侵入鄰近組織，甚至通過血液或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處部位，形成轉(zhuǎn)移性癌癥。

2.1.3 與癌癥的關(guān)系
E-cadherin的表達(dá)下降或β-catenin定位異常（例如從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核）常與癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移性增加有關(guān)。

這些變化通常標(biāo)志著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的啟動(dòng)，這是一個(gè)在癌癥發(fā)展中常見的現(xiàn)象，涉及細(xì)胞從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。

2.2 CD44
CD44是一種跨膜糖蛋白，在正常和癌組織的細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。參與細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞粘附和遷移。高水平的CD44表達(dá)與癌癥進(jìn)展有關(guān)。

2.3 ZO-1 (Zonula Occludens-1)
ZO-1是一種支架蛋白，決定上皮細(xì)胞形成緊密連接鏈。緊密連接確保質(zhì)膜頂端和基底外側(cè)區(qū)域之間的分離，并作為擴(kuò)散屏障，介導(dǎo)細(xì)胞遷移。ZO-1的表達(dá)維持氣道和肺泡上皮血管之間的屏障，表明緊密連接的存在。

ZO-1表達(dá)異常，緊密連接功能障礙會(huì)破壞上皮屏障，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和腫瘤轉(zhuǎn)移。

在這項(xiàng)研究中，研究了在3D生物打印的甲基丙烯酸明膠(GelMA)或基質(zhì)凝膠液滴中肺癌細(xì)胞從單細(xì)胞重排到球體以及緊密連接的表達(dá)，并與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了比較。
 

圖1所示：生物打印和連接蛋白信號(hào)通路的說明

03  材料和方法
☆☆細(xì)胞培養(yǎng)

• 人肺癌A549細(xì)胞系在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

• A549細(xì)胞以800萬個(gè)細(xì)胞/mL的濃度與GelMA或Matrigel Matrix混合，并通過22G噴嘴以10µL的液滴形式分配。

☆☆3D生物打印和培養(yǎng)

• GelMA生物墨水用BIO X™ 3D生物打印機(jī)打印并使用405 nm光模塊進(jìn)行光交聯(lián)。

• Matrigel手動(dòng)分配到96孔板中并在37℃下進(jìn)行30分鐘的熱交聯(lián)。

• 樣品在37°C和5% CO2下培養(yǎng)，每周三次更換培養(yǎng)基，分別在3D或2D環(huán)境中培養(yǎng)14天或4天。

☆☆細(xì)胞固定與染色

• 3D構(gòu)建體固定、脫水、浸潤、石蠟包埋及切片處理（具體方法見附件1）。

• 2D細(xì)胞固定、滲透及阻斷處理。

• 使用特定抗體（β-catenin、CD44、ZO-1）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和共聚焦成像。
   

圖2：第4天A549的2D亮場(chǎng)圖像，第14天嵌入GelMA和Matrigel。比例尺= 100µm

生物墨水內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)及其重新排列環(huán)境的能力至關(guān)重要。A549細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈�環(huán)境中能夠自然自組裝成球體。從亮場(chǎng)圖像（圖2）可以明顯看出，A549細(xì)胞在2D環(huán)境中以單細(xì)胞的形式生長，具有平坦的形態(tài)，而在生物打印過程中，當(dāng)A549細(xì)胞作為分散的單細(xì)胞嵌入GelMA和Matrigel中時(shí)，14天后，細(xì)胞在生物墨水中自然聚集并形成球體。球體的大小和形狀的差異可能表明更類似于體內(nèi)的模式，但可能是不同腫瘤模型中數(shù)據(jù)差異的來源。

對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行β-catenin染色分析顯示，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中存在不同的表達(dá)模式（圖3）。在不同細(xì)胞區(qū)室的定位與其在質(zhì)膜上的功能有關(guān)，在質(zhì)膜上它與細(xì)胞粘附蛋白（如E-cadherin）相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用。結(jié)果表明，在二維培養(yǎng)模型中存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)定位，而在三維培養(yǎng)模型中表達(dá)定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接。先前的研究顯示了3D培養(yǎng)中A549細(xì)胞的自然環(huán)境的相關(guān)再現(xiàn)，其中β-catenin表達(dá)定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接處，表明極化和粘糖蛋白的產(chǎn)生，而2D培養(yǎng)則沒有（Carterson, 2015）。
 

圖3：A549 β-catenin在2D單層細(xì)胞中的表達(dá)于第4天，在GelMA和Matrigel的3D培養(yǎng)中于第14天。為了更好地可視化定位，對(duì)每個(gè)條件下的圖像處理進(jìn)行了優(yōu)化。比例尺= 100µm
 

圖5：ZO-1在A549中的表達(dá)(紅色)和DAPI(藍(lán)色)。所有的照片都是用相同的曝光時(shí)間拍攝的。比例尺= 100µm

與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D生物打印具有多種優(yōu)勢(shì)，包括多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精確幾何排列，可以更好地再現(xiàn)天然的3D人體生理。細(xì)胞根據(jù)來自周圍細(xì)胞和環(huán)境的外部信號(hào)進(jìn)行自我組裝。這一重要現(xiàn)象有助于理解腫瘤的形成，并有潛力促進(jìn)藥物開發(fā)和篩選。

04 結(jié)果與討論
4.1 細(xì)胞形態(tài)和球體形成

• A549細(xì)胞在2D環(huán)境中以單細(xì)胞形式生長，形態(tài)扁平。

• 在3D生物打印過程中，A549細(xì)胞在GelMA和Matrigel中聚集并形成球體，模擬體內(nèi)環(huán)境。

4.2 腫瘤標(biāo)志物表達(dá)

• β-catenin染色顯示在3D培養(yǎng)模型中表達(dá)定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接處，而在2D培養(yǎng)模型中存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)定位。

• 3D培養(yǎng)模型中的A549細(xì)胞表現(xiàn)出更具生理相關(guān)性的β-catenin表達(dá)模式。

4.3 細(xì)胞重排和微環(huán)境重塑

• 在GelMA和Matrigel中，A549細(xì)胞在14天內(nèi)聚集成球體，而在二維樣品中未見此現(xiàn)象。

• 球體結(jié)構(gòu)是藥物開發(fā)和理解細(xì)胞過程的重要工具，能夠增加細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用，模擬體內(nèi)癌癥模型。

05 參考文獻(xiàn)
見網(wǎng)址：
https://go.pardot.com/l/894101/2020-11-23/qxj/894101/1606150763BkyhQhDN/In_Vitro_Lung_Cancer_Model_Application_Note_112020v5.pdf