InnoScan文獻快訊—
環(huán)境藍細菌高通量檢測微陣列芯片
 
   
摘要：環(huán)境藍細菌因其在生態(tài)系統(tǒng)中的關鍵作用而備受關注。 中國研究團隊近期開發(fā)了一種名為 CyanoStrainChip 的新型DNA 微陣列芯片，可對環(huán)境藍細菌進行菌株水平的全面分析。 通過 43,666個全基因組、菌株特異性探針涵蓋幾乎所有藍細菌主要類群。 使用CyanoStrainChip無需培養(yǎng)藍細菌，與傳統(tǒng)方法相比成本更低，計算要求更低，定量效果更好。
   
 
 
      藍細菌代表一個廣泛而普遍存在的光合自養(yǎng)原核生物門，以其非凡的遺傳多樣性而聞名。這些微生物存在于幾乎所有環(huán)境中，并在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，不僅是地球大氣氧氣的重要貢獻者，還是次生代謝產(chǎn)物的多產(chǎn)者。在某些情況下，藍細菌會導致有害的水華，釋放毒素進入淡水和海洋環(huán)境，對生態(tài)系統(tǒng)結構和功能，以及用于娛樂、飲用水、漁業(yè)和人類健康的水質構成嚴重威脅。事實上，在各種生態(tài)系統(tǒng)中對藍細菌多樣性和豐度進行分析將對生態(tài)研究和有害藻華監(jiān)測、評估和管理至關重要。
      然而，當前研究普遍忽視了藍細菌種內多樣性，導致在種或以上的概括性結論，并未考慮菌株差異的可能性。許多屬于同一藍細菌屬（或種）的多個分離株比較研究，如 Raphidiopsis、Planktothrix 和 Microcystis，證明它們在形態(tài)、生理、毒素和遺傳學方面存在相當大的種內多樣性。但是目前環(huán)境藍細菌的高通量檢測方法很難達到菌株水平。基于聚合酶鏈反應 (PCR) 的靶向標記基因DNA 測序是克服藍細菌多樣性評估中表型表征局限性，最廣泛使用的技術。早在1997年，就開發(fā)出了一組用于特異性擴增藍細菌16S rRNA基因片段的寡核苷酸引物。然而，這些基于PCR的測序方法無法在物種或以下進行鑒定，因為DNA片段只有幾百個核苷酸長，其分辨率受到限制。過去十年來，對環(huán)境樣本核酸進行直接宏基因組測序已成為探索復雜環(huán)境微生物群落組成的有力工具。雖然通過生物信息學工具（如 inStrain 和 PStrain）可成功識別群落中的菌株，但仍然存在一定的局限性。鑒于環(huán)境樣品的高復雜性，通常需要足夠的序列深度來提高靈敏度和特異性，這也意味著巨大的測序和計算成本，這對許多研究人員來說仍然不可負擔。此外，技術重現(xiàn)性低，并且在宏基因組分析中準確量化密切相關菌株的相對豐度存在困難，可能會引入顯著偏差。因此，需要一種新方法來解決現(xiàn)有方法的這些缺點。
      DNA微陣列最初由數(shù)萬個DNA片段排列在載玻璃片上，以進行基因表達分析。從那時起，各種類型的DNA微陣列已被開發(fā)用于不同環(huán)境中的微生物檢測，包括功能和分類分析。與基于測序的方法相比，微陣列具有幾個優(yōu)勢，包括高重復性、可靠的定量、相對可負擔的成本和易于使用。鑒于高密度微陣列技術的成熟和藍細菌基因組數(shù)據(jù)的快速積累，近期中國一研究團隊開發(fā)了 CyanoStrainChip，這是一種DNA微陣列芯片，用于環(huán)境藍細菌的高通量和高分辨率分類鑒定。該團隊設計了43,666個全基因組菌株特異性探針，用于靶向1277株藍細菌。通過體外模擬群落和野外樣品檢查該芯片的實用性和局限性。結果表明，該微陣列芯片能夠在復雜環(huán)境中準確地在菌種水平檢測藍細菌。
   
      CyanoStrainChip目標藍細菌菌株按主要類群呈現(xiàn)。藍細菌主要群體的分支關系，基于先前研究的系統(tǒng)發(fā)育分析，利用了834個藍細菌特異性通用單拷貝同源基因基準。
該芯片設計，一共使用了約2500個藍細菌基因組來設計特異性探針，其中包括163個基因組，這些基因組在該研究團隊之前的出版物中已測序，以及約2300個來自NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的基因組。為了減少數(shù)據(jù)集的冗余，采用FastANI來生成整個基因組的相似性計算指標，并將所有基因組在99%相似性閾值下聚類成菌株。對于每個菌株簇，保留一個代表性基因組進行下游分析。總共，有1277個基因組保留下來，包括458個純培養(yǎng)基因組、556個單一擴增基因組和263個宏基因組組裝基因組。
      采用基于k-mer的方法來發(fā)現(xiàn)菌株特異性寡核苷酸，根據(jù)寡核苷酸的各種性質（包括探針雜交自由能、熔解溫度、探針次級結構、特異性和復雜性）對候選探針進行過濾。對于每個菌株，如果剩余探針足夠多，則選擇30-40個特異性探針；否則，保留所有剩余探針。選擇的探針被提交到Agilent eArray 5.0程序進行微陣列定制（客制CGH，8×64K平臺）。
CyanoStrainChip數(shù)據(jù)的預處理。在InnoScan 900掃描儀（該型號現(xiàn)已更新為InnoScan 910）   上掃描的微陣列tiff圖像通過Agilent Feature Extraction（AFE）軟件處理，以生成樣品點原始強度和一系列統(tǒng)計指標。在進行下游分析之前，采取幾個微陣列數(shù)據(jù)預處理步驟來抵消系統(tǒng)性變化并過濾假陽性。
     
 
 
 
文獻原文鏈接：  https://doi.org/10.1021/acs.est.3c11096