導讀：描述了一種基于凝集素的懸浮細胞生物傳感器，可利用QCM技術(shù)無標記檢測腫瘤細胞表面糖基與蛋白相互作用的結(jié)合動力學。與傳統(tǒng)的生物傳感器相比，這種細胞生物傳感器能夠?qū)崟r、無標記地原位檢測懸浮腫瘤細胞表面的糖基化情況，獲得更加接近于生物環(huán)境下的相互作用信息。

借用白同學的短視頻話語：“今天是三甲子，三甲子帶來新的生命起始”。作為生命科學儀器的供應商，三十年時間內(nèi)看到了很多方法學帶來的商業(yè)起伏，QCM是屬于不溫不火的一類方法學，原因可能是應用領(lǐng)域的研究開發(fā)以及推廣使用的不足，我們希望將三甲子的運氣帶給QCM。
我們在2023年末選擇了十年前的這篇文獻，作為2024年的開篇，致敬裴志超教授團隊！也感謝第一作者李學明博士對本文做了認真的修改和校正！
2013年裴志超團隊發(fā)表在《Chemical Communications》中題為“A suspension-cell biosensor for real-time determination of binding kinetics of protein-carbohydrate interactions on cancer cell surfaces”的研究論文，首次提出了一種懸浮細胞QCM生物傳感器，并將其應用于評估懸浮細胞表面糖基化情況及其與蛋白的結(jié)合動力學研究。

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/CC/c3cc45006f

1. QCM懸浮細胞芯片的制備

研究人員首先將LNB-羧基芯片插入Attana細胞生物傳感器中。芯片表面的羧基經(jīng)EDC-sulfo-NHS活化，然后通過氨基偶聯(lián)的方法將凝集素Con A共價結(jié)合到芯片表面，芯片上未反應完全的活化羧基用乙醇胺封閉（圖1中的步驟i、ii）。然后，通過凝集素Con A與細胞表面糖基的相互作用將懸浮細胞（人急性髓細胞白血病細胞K562和人急性淋巴細胞白血病細胞Jurkat）捕獲到芯片表面（圖1中的步驟iii）制得QCM懸浮細胞芯片。將不同種類或濃度的凝集素溶液進樣到QCM懸浮細胞芯片表面，凝集素與細胞表面糖基的相互作用（結(jié)合或解理）通過QCM生物傳感器實時檢測，獲得豐富的相互作用信息（圖1中的步驟iv）。    

 
為了評估懸浮細胞在芯片表面的捕獲情況，可以使用Hoechst染料對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下進行觀察。如圖2所示，懸浮細胞已被成功地捕獲到了芯片上，且細胞分布均勻。
 

圖2 熒光顯微鏡下觀察芯片表面的細胞捕獲情況

2. 細胞表面糖基化情況研究

凝集素作為一種能夠高度特異性識別并結(jié)合特定結(jié)構(gòu)糖基的蛋白，已成為研究腫瘤細胞表面糖基化的一個重要工具。如麥胚凝集素（WGA）、伴刀豆球蛋白A（Con A）、大豆凝集素（SBA）、荊豆凝集素I（UEA-I）和花生凝集素（PNA）能夠分別特異性識別并結(jié)合細胞表面的N-乙�；�葡糖胺、甘露糖/葡萄糖、N-乙�；�半乳糖胺、L-巖藻糖和半乳糖殘基。通過檢測腫瘤細胞與這一系列凝集素的相互作用可以對腫瘤細胞表面的糖基化情況進行評估。

研究人員分別將兩種不同類型的懸浮細胞（人急性髓細胞白血病細胞K562和人急性淋巴細胞白血病細胞Jurkat）捕獲到芯片表面，制得QCM懸浮細胞芯片，并對這兩種細胞表面的糖基化情況進行了研究。如圖3所示，WGA對Jurkat細胞具有較高的響應值（123 Hz）說明Jurkat細胞表面具有高表達量的N-乙�；�葡糖胺，而K562細胞表面具有較低水平的N-乙�；�葡糖胺（48 Hz）。Con A和SBA對Jurkat細胞的響應值分別為：29 Hz和15 Hz，對K562細胞的響應值分別為24 Hz和10 Hz，兩者相差不大，說明兩種細胞表面葡萄糖/甘露糖和N-乙�；�半乳糖胺表達量較接近。UEA-I對K562細胞的響應值為12 Hz，而對Jurkat細胞的響應值只有2.8 Hz，說明K562細胞表面較Jurkat細胞表面具有較高水平的L-巖藻糖表達。PNA對兩種細胞的響應值均很弱說明兩種細胞表面的只有微量的半乳糖表達。由此可見，不同的凝集素對不同的細胞的響應值差異表明了細胞表面的糖基化差異情況。    

 

3. 分子與細胞相互作用動力學研究

基于QCM技術(shù)的細胞生物芯片能夠直接在細胞表面檢測分子與細胞的相互作用，并能夠獲得相互作用的動力學數(shù)據(jù)。

如圖4所示，研究人員通過檢測一系列濃度的凝集素SBA與K562細胞的相互作用（檢測凝集素與細胞的結(jié)合過程105 s、解離過程295 s）。結(jié)合－解離曲線用Attana分析軟件進行擬合分析，獲得SBA與K562細胞相互作用的動力學數(shù)據(jù)：結(jié)合速率常數(shù)k_on = 7.56 × 10⁴ M^-1 s^-1、解離速率常數(shù)k_off = 3.89 × 10^-4 s^-1，以及親和常數(shù)K_D = 5.15 nM。（圖中黑色曲線為實際所測SBA與K562細胞相互作用曲線，紅色曲線為軟件擬合曲線）    

 

圖4 SBA與K562細胞相互作用的動力學研究

結(jié) 論

研究人員提出了一種新穎的基于QCM技術(shù)的無標記懸浮細胞生物芯片，用于實時檢測凝集素與細胞表面糖基的相互作用。將凝集素Con A共價修飾到QCM芯片表面，通過懸浮細胞表面的糖鏈與芯片表面Con A的特異性相互作用將懸浮細胞固定到芯片表面，制備QCM懸浮細胞生物芯片，并對這兩種懸浮腫瘤細胞表面糖基化情況及其與凝集素相互作用的動力學進行了研究。該研究所制備的懸浮細胞生物芯片可實時、無標記檢測懸浮細胞表面的生物分子與蛋白的相互作用，并進行相互作用的動力學研究，為研究懸浮細胞表面的糖基化情況提供了一種方便簡潔、快速高效的新方法，為深刻理解和研究細胞表面的分子識別過程提供了一種新研究手段。

參考資料：

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/CC/c3cc45006f

Attana分子與細胞相互作用檢測儀是基于石英晶體微天平（QCM）技術(shù)原理，可實時、無標記的檢測分子相互作用的系統(tǒng)。目前已在動力學反應、抗原抗體反應、競爭力分析、有效濃度檢測、抗原表位定位、粗樣篩選、候選藥物的篩查等領(lǐng)域廣泛應用。

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