如何破解細胞大小之謎，一直是生命科學領域的熱門話題。很早就清楚細胞大小源于細胞生長和分裂的頻率平衡，決定了細胞內的幾何結構和細胞器大小，并影響細胞產生蛋白質和其他分子的方式，進而影響生物合成過程。同時細胞大小結合細胞周期的變化，反映了生物體新陳代謝和對環(huán)境的生理適應的變化。最近，諸多研究者聚焦于細胞大小中細胞質量或細胞體積的控制機制研究。細胞體積可通過庫爾特原理或3D顯微鏡進行測量，單個細胞的質量定量則是直接記錄浮力或干質量（主要由生物合成和降解的總和決定）。如果細胞體積在生長過程中與細胞干質量成比例，則細胞質量密度保持恒定，可以用細胞干質量除以細胞體積來計算。然而細胞的生命活動紛繁復雜，例如生長、分化或衰老，以及細胞類型不同，導致細胞大小和體積的變化，從而引起細胞干質量和細胞體積的比例關系隨之改變。因此如何較為穩(wěn)定的實現細胞質量密度的測量受到了研究者的關注。

 

最理想的方式是直接、準確地測量細胞的質量密度，但是現有的幾種方式皆有局限性，誤差較大。為此，來自哈佛醫(yī)學院的Xili Liu等人開發(fā)了歸一化拉曼成像-Normalized Raman Imaging （NoRI）。NoRI能夠對活細胞或光學切片固定細胞中的蛋白質、脂質和水密度進行無標記的直接測量；總質量通過細胞體積上的質量密度積分，基于z堆疊圖像計算，靈敏度可達15 mg/ml。相關研究以“The uniformity and stability of cellular mass density in mammalian cell culture“為題，發(fā)表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上。
 

本研究采用三種不同類型的哺乳動物細胞系，HeLa (CCL-2人癌癥細胞系），NIH3T3 (CRL-1658，狗上皮細胞系）和RPE-1 (CRL- 4000)，小鼠纖維細胞系），使用NoRI顯微鏡直接測量細胞中蛋白質和脂質的質量密度，研究質量密度如何對細胞外的滲透應激、蛋白質合成的抑制、蛋白質降解的抑制、細胞骨架破壞和其他生理狀態(tài)變化等各種擾動做出反應。作者將上述三種細胞分別在饑餓培養(yǎng)基（無血清，滲透壓350mOsm）、+200mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓542 mOsm）、+400mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓742 mOsm）、低滲培養(yǎng)基（滲透壓158mOsm）以及雷帕霉素、環(huán)己酰胺、諾可唑和Ouabain八水合物等藥物中進行處理，處理完成后對細胞的蛋白質合成速率、細胞增殖、SAβ-半乳糖苷酶活性和免疫熒光多項指標進行檢測。SE蛋白染色法（固定細胞染色后通過熒光顯微鏡成像）估算細胞的干質量，Coulter原理測量細胞體積，NoRI顯微鏡測量細胞中蛋白質和脂質的質量密度以及細胞周期。檢測相關圖像及數據均由Matlab（Mathworks）或Image J（National Institute of Health）的自定義設置和分析。

 

文章中對于細胞體積的測量，采用了Orflo Technologies公司提供的Moxi Go II，庫爾特原理的快速流式細胞儀，具體操作：0.05%或0.25%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化細胞， 重懸于相應的藥物或滲透壓DMEM中，然后選擇預設程序“細胞計數（僅限大�。�”完成細胞體積的測量。在Moxi GOⅡ測量結果中，細胞樣本中的碎片或死細胞可通過設置細胞的直徑門控而排除掉。

部分結果如下：

 

圖1. 在MDCK和HeLa細胞中，細胞大小隨滲透擾動而變化：A，C，在MDCK（A）和HeLa（C）細胞中，通過SE蛋白染色估算的干質量變化。B，D，在MDCK（B）或HeLa（D）細胞中，通過庫爾特原理測量的細胞體積變化。在低或+200mOsm高滲培養(yǎng)基中處理1小時或在3μM ouabain中處理5小時后測量細胞。N=8524-16257個細胞（干質量），N=3145-8000個細胞（體積）。（A-D）中的紅色虛線表示對照樣品的中位數。

 

圖2. 細胞骨架擾動增加了HeLa和MDCK細胞中的蛋白質密度。細胞在5μM 細胞松弛素D（+CytoD）或5μM諾可唑（+Noco）中處理1小時。A，I，通過SE熒光估算細胞干質量。B，J，通過庫爾特原理測量的細胞體積。C，K，通過OPP脈沖標記與SE蛋白質染色比率（OPP/SE）定量蛋白質合成速率。

研究者通過比較細胞體積、細胞干質量和細胞質量密度的變化系數發(fā)現，蛋白質和脂質密度在不同類型的細胞內表現都高度一致。雖然細胞質量密度在細胞周期中變化不大，但是和YAP（ Hippo通路中的關鍵轉錄輔因子）定位之間存在功能聯系，又會因外部滲透脅迫、細胞骨架破壞以及細胞的衰老和饑餓等發(fā)生改變。這些差異反應可以幫助我們了解生理和病理條件下細胞大小和質量密度調節(jié)的本質。

Moxi GO II
 

Moxi GO II采用庫爾特原理進行細胞計數和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據需要更換），進行細胞活率、細胞凋亡、轉染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。儀器設計小巧輕便，無需預熱，開機即用，預設程序，觸屏操控，運行后10秒即可給出測試結果，使用后也無需清潔維護。無論是經驗豐富的流式專家，還是初試身手的實驗小白，Moxi Go II都可以助您輕松完成實驗。

環(huán)亞生物，生命科學產品全國性代理商，不斷把國外頂級的創(chuàng)新產品引入中國。環(huán)亞生物具備完善的公司運營、產品管理、營銷、售前技術支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為Orflo Technologies大中華區(qū)獨家代理商，負責Orflo產品大中華區(qū)的營銷和售后支持。

更多資訊請訪問文獻全文鏈接： 
https://doi.org/10.3389/fcell.2022.1017499

▼更多產品詳情，請聯系我們▼
環(huán)亞生物科技有限公司
地址：上海市閔行區(qū)友東路358號閔欣大廈1號樓701/703/705室
電話：021-54583565
郵箱：info@apgbio.com
網址：www.apgbio.com
 

▼更多精彩內容，請掃碼關注我們▼