ChIP-seq等在揭示NRF1促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活中的應(yīng)用
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cell，PGC）是生殖細(xì)胞前體，可以產(chǎn)生卵母細(xì)胞和精子，確保生命延續(xù)。盡管PGC特化（PGC specification）得到廣泛研究，但PGC種群在出生前遷移到胚胎性腺后如何維持和擴(kuò)大仍然難以捉摸。轉(zhuǎn)錄因子（如PRDM1/BLIMP1、PRDM14和TFAP2C）和信號分子（如BMP和WNT）在PGC特化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。核呼吸因子1（Nuclear respiratory factor 1，NRF1）是一種已知參與線粒體生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子。最近研究表明，在精子發(fā)生過程中，NRF1與生殖細(xì)胞特異性基因CpG富集的低甲基化啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，并直接激活其轉(zhuǎn)錄。目前研究揭示與周圍的體細(xì)胞相比，胚胎期遷移后的PGC中NRF1高表達(dá)，可能是由于PGC基因組逐漸低甲基化。此外，NRF1是PGC體外和體內(nèi)增殖和存活所必需的，且當(dāng)異位表達(dá)時(shí)，NRF1積極促進(jìn)PSC分化。
2023年8月4日，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生王鵬翔等為第一作者在《Cell Proliferation》雜志發(fā)表題為“NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival”的研究論文，該研究以原始生殖細(xì)胞（PGC）為研究對象，通過RNA-seq和ChIP-seq等實(shí)驗(yàn)表明NRF1通過調(diào)控支持PGC編程的廣泛轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和線粒體代謝，參與調(diào)控遷移后PGC存活和增殖。本研究為PGC發(fā)育背后的功能機(jī)制提供了新的線索，并驗(yàn)證NRF1是此過程中以前未被鑒定的調(diào)控因子。
標(biāo)題：NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival（NRF1促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活）
時(shí)間：2023-08-04
期刊：Cell Proliferation
影響因子：IF 8.5
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
NRF1是一種已知的線粒體代謝調(diào)控因子，在PGC遷移后發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育過程中，NRF1蛋白水平在PGC遷移后逐漸升高。胚胎生殖細(xì)胞的特異性Nrf1敲除導(dǎo)致PGC增殖和存活受損。此外，NRF1還可以主動(dòng)促進(jìn)多能干細(xì)胞的PGC分化。通過全轉(zhuǎn)錄組分析和ChIP-seq分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NRF1直接調(diào)控PGC形成中的關(guān)鍵信號分子、增殖和細(xì)胞周期中的轉(zhuǎn)錄因子以及線粒體代謝中的酶�？偟膩碚f，本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NRF1調(diào)控廣泛轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)以支持體外和體內(nèi)遷移后PGC發(fā)育。
研究結(jié)果
（1）生殖細(xì)胞中特異性Nrf1敲除破壞遷移后PGC發(fā)育
圖1：NRF1為原始生殖細(xì)胞（PGC）發(fā)育所必需。
（A） 用NRF1和OCT4抗體在E9.5小鼠胚胎上通過免疫組織熒光（IHF）檢測PGCs中NRF1表達(dá)。
（B） 用NRF1抗體和生殖細(xì)胞特異性蛋白DDX4抗體對E11.5–15.5胚胎性腺進(jìn)行IHF測定。（A-B）比例尺：50 μm。插入顯示了代表性區(qū)域放大圖像。
（C-D） 通過PGCs中的Tnap-Cre對野生型對照胚胎和Nrf1特異性敲除胚胎（Nrf1−/f-Cre）的E11.5–13.5性腺進(jìn)行IHF測定，抗Nrf1和OCT4抗體（C），抗Nrf1和DDX4抗體（D），用細(xì)胞核染料DAPI復(fù)染。比例尺：15 μm。（C）白色箭頭表示NRF1表達(dá)完全消失的OCT4+ PGC。
（2）PGCs中Nrf1缺失導(dǎo)致雄性和雌性小鼠不孕
圖2：Nrf1基因敲除導(dǎo)致雄性和雌性小鼠不孕。
（A） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠在P0和7周齡的睪丸形態(tài)。
（B） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠在8周齡時(shí)睪丸和附睪的組織學(xué)研究。
（C） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠7周齡的卵巢形態(tài)比較。
（D） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠7周齡的卵巢切片組織學(xué)研究。黑色箭頭和數(shù)字表示卵泡的不同發(fā)育時(shí)期。1：原代卵泡；2：次生卵泡；3：黃體。
（3）NRF1缺失破壞了遷移后PGCs的存活和增殖
圖3：NRF1是遷移后原始生殖細(xì)胞（PGCs）增殖和存活所必需的。
（A） 用p20-GFP或p20-Cre-p2a-GFP誘導(dǎo)分化的Nrf1f/f PSC的流式細(xì)胞術(shù)分析。通過SSEA1染色檢測GFP+PGC樣細(xì)胞（PGCLCs），右側(cè)顯示GFP+/SSEA1+PGCLC百分比。
（B） 使用BV421標(biāo)記的抗Ki67抗體通過流式細(xì)胞術(shù)分析（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC。
（C） 將（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC與BV421標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。（A–C）數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。***：p<0.001.
（D-E） E11.5時(shí)Nrf1−/f-Cre胚胎及其野生型同窩同伴小鼠生殖嵴上的免疫組織熒光（IHF），使用抗OCT4和Ki67的抗體（D），或OCT4和裂解的Caspase 3（CASP3）抗體（E）。白色箭頭表示Nrf1−/f-Cre胚胎中的OCT4+/Ki67非增殖PGCs（D）或OCT4+/Caspase3+凋亡PGCs（E）。比例尺：10 μm。
（4）NRF1過表達(dá)促進(jìn)PSC PGCLC形成
圖4：NRF1促進(jìn)PSC形成PGC樣細(xì)胞（PGCLC）。
（A） 通過real-time RT-PCR檢測BV+PGCLC中Nrf1和原始生殖細(xì)胞（PGC）標(biāo)記基因的相對mRNA水平，與從BVSC PSC分化的BV−體細(xì)胞進(jìn)行比較。
（B） 與對照組（Ctrl）相比，內(nèi)源性Nrf1激活（Nrf1a）時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BV+PGCLC。
（C） 內(nèi)源性Nrf1激活后，通過real-time RT-PCR檢測第6天EB的相對mRNA水平。（A–C）數(shù)據(jù)以兩次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。
（D） BVSC PSCs分化第5天的流式細(xì)胞術(shù)分析。在PSC分化的第2-5天，通過DOX處理誘導(dǎo)NRF1表達(dá)（p20-NRF1）。使用相同DOX處理的空載體作為對照（p20）。左圖為流式細(xì)胞術(shù)的代表性結(jié)果，中間panel為BV+PGCLC百分比。右圖為BVSC PSC分化第5天EB的代表性圖像。
（E） real-time RT-PCR檢測第5天分化的EBs中Nrf1和PGC標(biāo)記基因的mRNA水平。在PSC分化的第2-5天，通過DOX處理誘導(dǎo)NRF1表達(dá)。（D–F）數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。（A-F）*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。N.S.：無顯著性。
（5）NRF1是直接調(diào)控PGC形成、線粒體代謝和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因
圖5：NRF1調(diào)控轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)PSCs分化為PGC樣細(xì)胞（PGCLC）
（A） RNA-seq分析中差異表達(dá)基因的Venn圖，Log2倍數(shù)變化>0.58，p<0.05。
（B） 有或無NRF1過表達(dá)（OE）的BV+PGCLC的RNA-seq分析檢測到的基因火山圖。
（C） 有或無NRF1-OE的BV+PGCLC差異表達(dá)基因的GO分析（Log2倍數(shù)變化>0.58，p<0.05）。（D） 對DOX誘導(dǎo)的NRF1-OE（p20-NRF1）或空載體對照（p20）的BV+PGCLC的real-time RT-PCR分析。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。*: p < 0.05;**: p < 0.01。***: p < 0.001。
圖6：原始生殖細(xì)胞（PGCs）NRF1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)特征。
（A） 從BV+PGC樣細(xì)胞（PGCLCs）中進(jìn)行的ChIP-seq分析中獲得的NRF1結(jié)合motif。
（B） 從ChIP-seq分析中獲得的基因組區(qū)域NRF1結(jié)合位點(diǎn)分布。
（C） BV+PGCLC中NRF1結(jié)合的靶基因的GO分析。
（D） ChIP-seq分析的基因組區(qū)域中NRF1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的代表性peaks。
（E） 用NRF1抗體或IgG對照對BV+PGCLC的免疫沉淀的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。
參考文獻(xiàn)：
Wang P, Su J, Wang J, Xie Y, Chen W, Zhong J, Wang Y. NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival. Cell Prolif. 2023 Aug 4:e13533.
原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cell，PGC）是生殖細(xì)胞前體，可以產(chǎn)生卵母細(xì)胞和精子，確保生命延續(xù)。盡管PGC特化（PGC specification）得到廣泛研究，但PGC種群在出生前遷移到胚胎性腺后如何維持和擴(kuò)大仍然難以捉摸。轉(zhuǎn)錄因子（如PRDM1/BLIMP1、PRDM14和TFAP2C）和信號分子（如BMP和WNT）在PGC特化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。核呼吸因子1（Nuclear respiratory factor 1，NRF1）是一種已知參與線粒體生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子。最近研究表明，在精子發(fā)生過程中，NRF1與生殖細(xì)胞特異性基因CpG富集的低甲基化啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，并直接激活其轉(zhuǎn)錄。目前研究揭示與周圍的體細(xì)胞相比，胚胎期遷移后的PGC中NRF1高表達(dá)，可能是由于PGC基因組逐漸低甲基化。此外，NRF1是PGC體外和體內(nèi)增殖和存活所必需的，且當(dāng)異位表達(dá)時(shí)，NRF1積極促進(jìn)PSC分化。
2023年8月4日，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生王鵬翔等為第一作者在《Cell Proliferation》雜志發(fā)表題為“NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival”的研究論文，該研究以原始生殖細(xì)胞（PGC）為研究對象，通過RNA-seq和ChIP-seq等實(shí)驗(yàn)表明NRF1通過調(diào)控支持PGC編程的廣泛轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和線粒體代謝，參與調(diào)控遷移后PGC存活和增殖。本研究為PGC發(fā)育背后的功能機(jī)制提供了新的線索，并驗(yàn)證NRF1是此過程中以前未被鑒定的調(diào)控因子。
標(biāo)題：NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival（NRF1促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活）
時(shí)間：2023-08-04
期刊：Cell Proliferation
影響因子：IF 8.5
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
NRF1是一種已知的線粒體代謝調(diào)控因子，在PGC遷移后發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育過程中，NRF1蛋白水平在PGC遷移后逐漸升高。胚胎生殖細(xì)胞的特異性Nrf1敲除導(dǎo)致PGC增殖和存活受損。此外，NRF1還可以主動(dòng)促進(jìn)多能干細(xì)胞的PGC分化。通過全轉(zhuǎn)錄組分析和ChIP-seq分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NRF1直接調(diào)控PGC形成中的關(guān)鍵信號分子、增殖和細(xì)胞周期中的轉(zhuǎn)錄因子以及線粒體代謝中的酶�？偟膩碚f，本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NRF1調(diào)控廣泛轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)以支持體外和體內(nèi)遷移后PGC發(fā)育。
研究結(jié)果
（1）生殖細(xì)胞中特異性Nrf1敲除破壞遷移后PGC發(fā)育
圖1：NRF1為原始生殖細(xì)胞（PGC）發(fā)育所必需。（A） 用NRF1和OCT4抗體在E9.5小鼠胚胎上通過免疫組織熒光（IHF）檢測PGCs中NRF1表達(dá)。
（B） 用NRF1抗體和生殖細(xì)胞特異性蛋白DDX4抗體對E11.5–15.5胚胎性腺進(jìn)行IHF測定。（A-B）比例尺：50 μm。插入顯示了代表性區(qū)域放大圖像。
（C-D） 通過PGCs中的Tnap-Cre對野生型對照胚胎和Nrf1特異性敲除胚胎（Nrf1−/f-Cre）的E11.5–13.5性腺進(jìn)行IHF測定，抗Nrf1和OCT4抗體（C），抗Nrf1和DDX4抗體（D），用細(xì)胞核染料DAPI復(fù)染。比例尺：15 μm。（C）白色箭頭表示NRF1表達(dá)完全消失的OCT4+ PGC。
（2）PGCs中Nrf1缺失導(dǎo)致雄性和雌性小鼠不孕
圖2：Nrf1基因敲除導(dǎo)致雄性和雌性小鼠不孕。（A） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠在P0和7周齡的睪丸形態(tài)。
（B） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠在8周齡時(shí)睪丸和附睪的組織學(xué)研究。
（C） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠7周齡的卵巢形態(tài)比較。
（D） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窩出生對照小鼠7周齡的卵巢切片組織學(xué)研究。黑色箭頭和數(shù)字表示卵泡的不同發(fā)育時(shí)期。1：原代卵泡；2：次生卵泡；3：黃體。
（3）NRF1缺失破壞了遷移后PGCs的存活和增殖
圖3：NRF1是遷移后原始生殖細(xì)胞（PGCs）增殖和存活所必需的。（A） 用p20-GFP或p20-Cre-p2a-GFP誘導(dǎo)分化的Nrf1f/f PSC的流式細(xì)胞術(shù)分析。通過SSEA1染色檢測GFP+PGC樣細(xì)胞（PGCLCs），右側(cè)顯示GFP+/SSEA1+PGCLC百分比。
（B） 使用BV421標(biāo)記的抗Ki67抗體通過流式細(xì)胞術(shù)分析（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC。
（C） 將（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC與BV421標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。（A–C）數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。***：p<0.001.
（D-E） E11.5時(shí)Nrf1−/f-Cre胚胎及其野生型同窩同伴小鼠生殖嵴上的免疫組織熒光（IHF），使用抗OCT4和Ki67的抗體（D），或OCT4和裂解的Caspase 3（CASP3）抗體（E）。白色箭頭表示Nrf1−/f-Cre胚胎中的OCT4+/Ki67非增殖PGCs（D）或OCT4+/Caspase3+凋亡PGCs（E）。比例尺：10 μm。
（4）NRF1過表達(dá)促進(jìn)PSC PGCLC形成
圖4：NRF1促進(jìn)PSC形成PGC樣細(xì)胞（PGCLC）。
（A） 通過real-time RT-PCR檢測BV+PGCLC中Nrf1和原始生殖細(xì)胞（PGC）標(biāo)記基因的相對mRNA水平，與從BVSC PSC分化的BV−體細(xì)胞進(jìn)行比較。
（B） 與對照組（Ctrl）相比，內(nèi)源性Nrf1激活（Nrf1a）時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BV+PGCLC。
（C） 內(nèi)源性Nrf1激活后，通過real-time RT-PCR檢測第6天EB的相對mRNA水平。（A–C）數(shù)據(jù)以兩次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。
（D） BVSC PSCs分化第5天的流式細(xì)胞術(shù)分析。在PSC分化的第2-5天，通過DOX處理誘導(dǎo)NRF1表達(dá)（p20-NRF1）。使用相同DOX處理的空載體作為對照（p20）。左圖為流式細(xì)胞術(shù)的代表性結(jié)果，中間panel為BV+PGCLC百分比。右圖為BVSC PSC分化第5天EB的代表性圖像。
（E） real-time RT-PCR檢測第5天分化的EBs中Nrf1和PGC標(biāo)記基因的mRNA水平。在PSC分化的第2-5天，通過DOX處理誘導(dǎo)NRF1表達(dá)。（D–F）數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。（A-F）*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。N.S.：無顯著性。
（5）NRF1是直接調(diào)控PGC形成、線粒體代謝和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因
圖5：NRF1調(diào)控轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)PSCs分化為PGC樣細(xì)胞（PGCLC）（A） RNA-seq分析中差異表達(dá)基因的Venn圖，Log2倍數(shù)變化>0.58，p<0.05。
（B） 有或無NRF1過表達(dá)（OE）的BV+PGCLC的RNA-seq分析檢測到的基因火山圖。
（C） 有或無NRF1-OE的BV+PGCLC差異表達(dá)基因的GO分析（Log2倍數(shù)變化>0.58，p<0.05）。（D） 對DOX誘導(dǎo)的NRF1-OE（p20-NRF1）或空載體對照（p20）的BV+PGCLC的real-time RT-PCR分析。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。*: p < 0.05;**: p < 0.01。***: p < 0.001。
圖6：原始生殖細(xì)胞（PGCs）NRF1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)特征。（A） 從BV+PGC樣細(xì)胞（PGCLCs）中進(jìn)行的ChIP-seq分析中獲得的NRF1結(jié)合motif。
（B） 從ChIP-seq分析中獲得的基因組區(qū)域NRF1結(jié)合位點(diǎn)分布。
（C） BV+PGCLC中NRF1結(jié)合的靶基因的GO分析。
（D） ChIP-seq分析的基因組區(qū)域中NRF1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的代表性peaks。
（E） 用NRF1抗體或IgG對照對BV+PGCLC的免疫沉淀的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)的平均值±SEM表示。*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。
參考文獻(xiàn)：
Wang P, Su J, Wang J, Xie Y, Chen W, Zhong J, Wang Y. NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival. Cell Prolif. 2023 Aug 4:e13533.
標(biāo)簽：
ChIP-seq
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