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2022年9月，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院丁琛團(tuán)隊(duì)、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院侯英勇團(tuán)隊(duì)、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院沈坤堂、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院劉天舒團(tuán)隊(duì)和上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院趙健元團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》期刊(IF=17.694)發(fā)表的題為“ Proteomic characterization of gastric cancer response to chemotherapy and targeted therapy reveals potential therapeutic strategies”的研究成果，本研究通過(guò)分析了206個(gè)來(lái)自接受化療或抗her2治療的胃癌患者的腫瘤組織的蛋白質(zhì)組。

 

本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)的胃癌一線治療預(yù)測(cè)分類(lèi)器的構(gòu)建和驗(yàn)證，在一定程度上有助于個(gè)性化化療和靶向治療，從而走向蛋白質(zhì)組學(xué)驅(qū)動(dòng)的精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代。

 

更重要的是，本研究提出了一種全面的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)化療和靶向治療的反應(yīng)，提出CTSE聯(lián)合TKTL1可以促進(jìn)更有效的臨床決策，以確定基于doc的治療對(duì)患者的相對(duì)益處，暗示了其預(yù)后和治療意義以及可能有益于臨床實(shí)踐的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制，并為研究胃癌化療和靶向治療的機(jī)制和指標(biāo)提供了豐富的資源。

 

研究背景

 

胃癌（GC）是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。胃癌的危險(xiǎn)因素包括吸煙、高鹽飲食、高肉類(lèi)攝入量、膽汁反流和幽門(mén)螺桿菌感染等。目前，手術(shù)、化療和放療是胃癌的主要治療策略。

 

術(shù)前化療被認(rèn)為是一種標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，也是提高局部晚期GC患者生存率的一種很有前途的方法。

 

三聯(lián)化療DOS（多西紫杉醇、奧沙利鉑和S-1）和雙重化療XELOX（卡培他濱和奧沙利鉑）已被確定為治療局部和轉(zhuǎn)移性胃癌的一線治療方法。

 

最近的幾項(xiàng)第二階段的研究和最近的證據(jù)表明曲妥珠單抗與一系列治療模式的聯(lián)合使用已經(jīng)支持了曲妥珠單抗+ XELOX治療her2陽(yáng)性晚期GC8-11患者的有效性和安全性。

 

然而，與曲妥珠單抗+ XELOX相比，曲妥珠單抗+ DOS聯(lián)合治療效果較差，中位OS更短，這尚未在臨床中廣泛應(yīng)用，曲妥珠單抗聯(lián)合化療的耐藥機(jī)制尚不清楚。

研究思路

 

研究方法

1. 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組

2. MSI/MSS特性的評(píng)價(jià)

3. 單樣本基因集富集分析（ssGSEA）

4. 目標(biāo)PRM分析

5. 質(zhì)粒構(gòu)建

6. 慢病毒的產(chǎn)生和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)

7. 蛋白質(zhì)印跡法

8. 增殖試驗(yàn)

9. 免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法

 

研究結(jié)果

1.胃癌患者對(duì)化療和靶向治療的反應(yīng)

 

為了研究與化療和靶向治療反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)模式，作者收集了206例化療初期的胃癌患者的腫瘤組織，利用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE），隨后通過(guò)基于質(zhì)譜（MS）的標(biāo)簽進(jìn)行分析自由量化策略（圖1a），詳細(xì)的臨床特征見(jiàn)圖1b。

 

生存分析顯示，敏感組（S，N = 79)的生存率高于非敏感組（NS，N = 97）（圖1c）。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，每個(gè)樣本中有6369-8119個(gè)基因產(chǎn)物（GPs）(圖1d）。S（11258個(gè)GPs）和NS（11388個(gè)GPs）之間的蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋率沒(méi)有顯著差異（圖1e）。

圖1| 胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析綜述

 

2.GC隊(duì)列的蛋白質(zhì)組學(xué)分型及其與治療反應(yīng)的關(guān)系

 

作者對(duì)179個(gè)樣本的蛋白質(zhì)組譜進(jìn)行共識(shí)聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)4種GCs蛋白質(zhì)組亞型，其中28、56、75和20例患者分別分為G-I、G-II、G-III和G-II亞型（圖2a），非敏感患者（SD和PD）的百分比從G-I的40%增加到G-IV的80%(圖2b），在4個(gè)亞型中，G-IV的預(yù)后最差（log rank檢驗(yàn)，P<0.05）（圖2c）。

 

此外，作者確定了蛋白質(zhì)組亞型與治療亞隊(duì)列或TNM分期之間存在明顯的關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)與分級(jí)、勞倫類(lèi)型、原發(fā)部位或腫瘤純度均未觀察到（圖2b）。在G-II亞型中，我們觀察到糖酵解/糖異生和泛酸/輔酶a生物合成顯著富集（Fig. 2d）。

 

為了研究蛋白表達(dá)與治療耐藥性的相關(guān)性，作者使用來(lái)自癌癥依賴圖譜項(xiàng)目（DepMap）的胃癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)，分析了G-IV亞型中藥物敏感性顯著上調(diào)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與藥物依賴性的相關(guān)性。作者鑒定了5個(gè)蛋白，包括THSD4、SRPX2、TGFBI、THBS1和LAMB2，它們與藥物反應(yīng)（5-FU、奧沙利鉑或多西紫杉醇）高度相關(guān)（圖2e）。

 

作者觀察到過(guò)表達(dá)thsd4的MKN45細(xì)胞中多西紫杉醇、奧沙利鉑和5-FU的半抑制濃度值顯著高于空載體細(xì)胞（圖2f）。

圖2| 胃癌隊(duì)列的蛋白質(zhì)組學(xué)分型及其與臨床特征的關(guān)系

 

3.胃癌的MSS/MSI狀態(tài)與腫瘤免疫微環(huán)境和治療耐藥性相關(guān)

 

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)復(fù)旦GC隊(duì)列（FDGC）的蛋白質(zhì)組學(xué)分型算法在其他GC隊(duì)列中是否可行，作者將相同的FDGC分型算法應(yīng)用于三個(gè)獨(dú)立的胃癌患者隊(duì)列，觀察到FDGC亞型和EOGC亞型或ACRG亞型，但不是FDGC亞型和BPRC亞型（圖3a，b），這可能是由于FDGC亞型和EOGC亞型或ACRG亞型之間的成分相似，而B(niǎo)PRC隊(duì)列只包括彌漫型癌癥。

 

在ACRG隊(duì)列和FDGC隊(duì)列中，低MSI/MSS-sig與較差的臨床結(jié)果顯著相關(guān)（圖3d），這與之前的研究一致。

 

此外，MSI/MSS-sig高的胃癌具有氧化磷酸化特征，而MSI/MSS-sig低的胃癌具有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的高表達(dá)（圖3e）。G-IV亞型中一組細(xì)胞因子、參與抗原加工的蛋白和MHCII類(lèi)分子的持續(xù)下調(diào)（Fig. 3f）。與巨噬細(xì)胞M1相比，前體單核細(xì)胞聚集在G-IV亞型中（圖3g，h）。

圖3| FDGC分型算法在多個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中的應(yīng)用\以及MSI/MSS特征與臨床結(jié)果的相關(guān)性

 

進(jìn)一步分析表明，MSI/MSS-sig與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M1顯著相關(guān)（圖3i），對(duì)四種蛋白質(zhì)組亞型間顯著差異細(xì)胞類(lèi)型的生存分析顯示，IV期患者單核/巨噬細(xì)胞M1的xCell評(píng)分與預(yù)后顯著相關(guān)，而不是II期和III期（圖3j），同樣，這些結(jié)果也在獨(dú)立的ACRG隊(duì)列中得到了驗(yàn)證（圖3j）。

此外，巨噬細(xì)胞M1在MSI高組中HLA-DRA的生物標(biāo)志物HLA-DRB3和IL18在MSI/ MSS-sig高組顯著增加（圖3k）。IL18的高表達(dá)也反映了與IV期患者的預(yù)后顯著相關(guān)（圖3l）。

總的來(lái)說(shuō)，微衛(wèi)星穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞少的M1容易耐藥，預(yù)后較差（圖3m）。

 

4.T細(xì)胞受體信號(hào)通路在DOS和XELOX化療中發(fā)揮不同的作用

 

生存分析也表明，MSI-sig高水平的胃癌患者與DOS治療中的總生存期呈正相關(guān)，而沒(méi)有觀察到MSI/MSS-sig水平與XELOX治療的臨床結(jié)果之間的差異（圖4a）。根據(jù)圖4b所示的KEGG通路注釋?zhuān)瑢?duì)每組過(guò)多的蛋白進(jìn)行通路富集。

 

相反，在XELOX亞隊(duì)列中，TCR信號(hào)通路為在XNSG中富集，高表達(dá)代表預(yù)后不良（圖4c)。同時(shí)，TCR通路、GSEA分析顯示，TCR信號(hào)通路是在XELOX非敏感患者中富集的基因信號(hào)通路，在DSG中有效，該通路的高激活在接受XELOX治療的BPRC隊(duì)列中表現(xiàn)更好（圖4d）。

 

CD8 + Tcm、CD8+t細(xì)胞和cDC在XNSG中富集（圖4e）。在BPRC隊(duì)列中，XELOX等免疫效應(yīng)細(xì)胞也在XELOX非敏感患者中富集（圖4f）。

 

值得注意的是，在31種抗癌藥物中，多西紫杉醇的ICD成分排名前一名，表明多西紫杉醇誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的能力更高（圖4g）。在DSG和XNSG中發(fā)現(xiàn)的1099個(gè)蛋白的比例較高，這些蛋白參與了免疫調(diào)節(jié)和ERBB通路（圖4h）。

 

圖4| 敏感組和非敏感組治療亞隊(duì)列中蛋白和信號(hào)通路的差異表達(dá)

 

如圖4i所示，單變量cox分析確定了參與免疫調(diào)節(jié)的12種蛋白和ERBB信號(hào)通路在DOS亞隊(duì)列中與無(wú)病生存（DFS）呈正相關(guān)，而在XELOX亞隊(duì)列中呈負(fù)相關(guān)。NCI-N87細(xì)胞中XELOX和TRA的半抑制濃度值分別為36.6 μM和43.7μM（圖4j）。GSEA分析還顯示，TCR信號(hào)在XHSG中富集（P = 0.033），并與臨床結(jié)果呈正相關(guān)（圖4k）。xCell分析顯示，XHSG中CD4+t細(xì)胞、CD4 + Tcm、CD8 + Tcm等免疫細(xì)胞的豐度顯著增加（圖4l）。XNSG中CD4陽(yáng)性細(xì)胞和CD8陽(yáng)性細(xì)胞的比例高于XSG中（圖4m）。

 

綜上所述，曲妥珠單抗與XELOX聯(lián)合治療可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，TCR信號(hào)通路和CD8 + Tcm成為聯(lián)合治療的良好反應(yīng)標(biāo)志物（圖4n）。

 

 

5.ECM/PI3K-AKT通路的激活與抗her2靶向治療的耐藥性相關(guān)

 

作者重點(diǎn)關(guān)注HER2亞隊(duì)列，并將該亞隊(duì)列分為HER2敏感組（HSG）和非敏感組（HNSG）。HSG與HNSG之間的OS和PFS的預(yù)后有顯著性差異（圖5a）。Cox分析提示，ERBB2不能被認(rèn)為是HER2亞隊(duì)列中獨(dú)立的預(yù)后因素。這些結(jié)果反映了HER2表達(dá)水平與曲妥珠單抗耐藥性的低相關(guān)性（圖5b）。

 

KEGG通路富集分析顯示，HNSG具有ecm-受體相互作用、PI3K-AKT通路等特征。（圖5c、d）。此外，ECM與臨床結(jié)果呈負(fù)相關(guān)（圖5e），ECM蛋白如COL4A1、COL6A5、FN1、GP1BA、ITGA4、THBS3和THBS4在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系47中也有過(guò)多的比例（圖5f）。PI3K-AKT信號(hào)通路與ecm-受體相互作用通路的正相關(guān)性最高（圖5g）。

 

HNSG中凋亡相關(guān)蛋白，包括BCL2、BCL2L1、CASP3、CASP7和CDKN2A的下調(diào)（圖5h）。NCI-N87細(xì)胞中BUP和TRA的半抑制濃度值分別為8.19 μM和46.57μM（圖5i）。

 

綜上所述，ECM可激活PI3K-AKT通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而削弱曲妥珠單抗的抗腫瘤作用（圖5j）。

圖5| HSG/ HNSG中蛋白和信號(hào)通路的差異表達(dá)

 

6.胃癌化療及靶向治療預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

 

作者比較確定s-過(guò)度代表和ns-過(guò)度代表的蛋白質(zhì)組是否可以區(qū)分敏感GC患者和非敏感GC患者對(duì)DOS治療、XELOX治療、抗her2治療或聯(lián)合化療的反應(yīng)（圖6a）。通過(guò)對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行了10倍交叉驗(yàn)證，獲得了3個(gè)預(yù)測(cè)模型，其具有高靈敏度和特異性的預(yù)測(cè)模型（圖6b）。此外，熱圖顯示，在新的獨(dú)立隊(duì)列中，DSG與DNSG、XSG和XNSG、HSG和HNSG之間分別有明顯的分離（圖6c）。

圖6| 預(yù)測(cè)性分類(lèi)器的構(gòu)建與驗(yàn)證

 

7.過(guò)表達(dá)CTSE通過(guò)穩(wěn)定微管協(xié)同提高了對(duì)多西紫杉醇的敏感性

 

與細(xì)胞轉(zhuǎn)染一個(gè)空載體，CTSE過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)MKN45和MGC803細(xì)胞的增殖（圖7a，b）,CTSE過(guò)表達(dá)組的半抑制濃度值（圖. 7c），而XELOX無(wú)明顯變化（圖7d），CTSE過(guò)表達(dá)組的DOC半抑制濃度值低于對(duì)照組（圖7e）。

 

對(duì)未經(jīng)處理的CTSE過(guò)表達(dá)和對(duì)照MKN45細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，971個(gè)上調(diào)的GPs在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子中富集。進(jìn)一步的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，CTSE過(guò)表達(dá)使MKN45細(xì)胞容易發(fā)生壞死，這表明CTSE對(duì)DOC有積極的反應(yīng)（圖7g）。

 

通過(guò)免疫印跡分析，驗(yàn)證CTSE組的DOC暴露降低了可溶性α-和β-微管蛋白亞基的含量，表明微管蛋白向微管的聚合增強(qiáng)，從而提高了DOC的敏感性（圖7h）。

 

8.過(guò)表達(dá)TKTL1，通過(guò)誘導(dǎo)異常的染色體分離，降低了對(duì)多西紫杉醇的敏感性

 

TKTL1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MKN45和MGC803細(xì)胞系的細(xì)胞增殖（圖7i，j）。通過(guò)比較TKTL1過(guò)表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞對(duì)DOS和XELOX的敏感性，發(fā)現(xiàn)TKTL1過(guò)表達(dá)細(xì)胞，而XELOX沒(méi)有顯著變化（圖7k，l）。過(guò)表達(dá)TKTL1組DOC的半抑制濃度值高于對(duì)照組（圖7m）。

 

在doc處理的tktl1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中觀察到嚴(yán)重的異常染色體分離表型，包括染色體錯(cuò)位、多極和滯后染色體（圖7n）。與doc處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，在doc處理的tktl1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中觀察到非整倍體性增加（圖7o）。

 

在該模型中，CTSE通過(guò)微管穩(wěn)定作用作為DOC化學(xué)敏感性的細(xì)胞內(nèi)在增強(qiáng)劑，而TKTL1通過(guò)誘導(dǎo)異常染色體分離作為衰減劑（圖7p）。

圖7| 過(guò)表達(dá)CTSE和TKTL1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞系MKN45和

MGC803中DOS和XELOX抗癌活性的影響

 

研究解讀

1. 構(gòu)建了一個(gè)涵蓋三個(gè)臨床治療亞隊(duì)列的胃癌隊(duì)列，包括DOS亞隊(duì)列（44例接受DOS治療）、XELOX亞隊(duì)列（70例接受XELOX治療）和HER2亞隊(duì)列（71例接受抗HER2治療的患者）。

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)聚類(lèi)的結(jié)果是四種具有不同功能的GC分子亞型，顯示出與藥物反應(yīng)和臨床結(jié)果相關(guān)。

3. 在其他獨(dú)立的胃癌隊(duì)列中驗(yàn)證了胃癌分型及其預(yù)后差異。

4. MSI-sig高狀態(tài)的胃癌患者對(duì)DOS治療反應(yīng)敏感，而對(duì)XELOX治療反應(yīng)不敏感。

5. 曲妥珠單抗與XELOX或PI3K-AKT抑制劑的體外協(xié)同作用。

6. 開(kāi)發(fā)了具有高精度的預(yù)后模型來(lái)預(yù)測(cè)化療反應(yīng)，在60例GC患者(XELOX（N=20）、XELOX（N = 20）、XELOX（N = 20）或抗her2（N=20）治療。

7. CTSE作為多西紫杉醇化學(xué)敏感性的細(xì)胞內(nèi)在增強(qiáng)劑，而TKTL1作為多西紫杉醇的衰減劑。