很多小伙伴都疑惑，細(xì)胞被支原體污染后的特征是什么？如何鑒別細(xì)胞被支原體污染了？今天，我?guī)Т蠹曳窒韮蓚�(gè)支原體污染的案例，共同探尋一下細(xì)胞被支原體污染后的特征。
 

圖1 感染支原體的EBTr（牛胚氣管細(xì)胞）

先來(lái)觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細(xì)胞（圖1），由成纖維樣逐漸變得類(lèi)上皮樣；質(zhì)膜鋪展，潰爛；輪廓不清，邊界模糊。再看右圖，細(xì)胞處于邊增殖邊凋亡的狀態(tài)，漂浮凋亡細(xì)胞過(guò)多。

圖2 感染支原體的HT1080（人纖維肉瘤細(xì)胞）

接下來(lái)再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080（圖2），由上皮樣逐漸變得類(lèi)成纖維樣，胞體細(xì)長(zhǎng)，和前面的牛胚氣管細(xì)胞形態(tài)變化剛好相反；偽足伸長(zhǎng)，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象，表明細(xì)胞可能在“痛苦”地遷移。使用了支原體殺除試劑，徹底根除了支原體以后，如右圖所示，細(xì)胞逐漸恢復(fù)了上皮樣形態(tài)，拉絲減少。

圖3 細(xì)胞膜上的支原體集落

接下來(lái)，給大家展示貼附在細(xì)胞膜上的支原體集落（圖3），支原體是目前已知最小的原核生物，直徑大小在0.1-0.3um，比細(xì)菌還要小。支原體可在培養(yǎng)液、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)增殖。單個(gè)支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態(tài)，圖中膜上的黑點(diǎn)為支原體集落。細(xì)胞背景干凈，形態(tài)沒(méi)有大的變化，但質(zhì)膜粗糙，布滿(mǎn)黑點(diǎn)。
 

總結(jié)下來(lái)，細(xì)胞被支原體污染的主要特征如下：

✔ 增殖減慢；

✔ 上清液澄澈；

✔ 背景干凈；

✔ 細(xì)胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）；

✔ 更換新的培養(yǎng)液細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有恢復(fù)。

細(xì)胞被支原體污染后的共性表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減慢、上清液澄澈、背景干凈，這3點(diǎn)可以明確地排除真、細(xì)菌污染。值得一提的是，當(dāng)給細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)體系不佳時(shí)，細(xì)胞也會(huì)表現(xiàn)出形態(tài)異常，所以，我們可以給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液，如果細(xì)胞也沒(méi)有恢復(fù)正常形態(tài)，此時(shí)判斷細(xì)胞極有可能被支原體“附身”了。
 

上述的判斷方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，日常細(xì)胞培養(yǎng)中，我們還可以用PCR擴(kuò)增試劑盒檢測(cè)細(xì)胞是否有支原體污染。
 

支原體檢測(cè)試劑盒（PCR法）使用方法
 

1、樣品準(zhǔn)備

取適量待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中（如果是血清樣本，可用 Mycoplasma Free Water 稀釋?zhuān)�，利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板；
 

2、PCR體系配制

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water）與陽(yáng)性對(duì)照（在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為T(mén)emplate），實(shí)驗(yàn)時(shí)戴一次性口罩與手套，謹(jǐn)慎操作，防止操作不當(dāng)引入外源支原體污染；
 

3、PCR程序設(shè)置

表2

4、凝膠電泳

取10μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；
 

5、結(jié)果分析

每次實(shí)驗(yàn)通過(guò)與陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果比較確認(rèn)樣品支原體污染情況，陽(yáng)性條帶大小500bp左右。如陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果中有條帶很有可能是PCR體系中出現(xiàn)污染，建議重新實(shí)驗(yàn)確認(rèn)結(jié)果。如有必要，也可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序，以確定具體的支原體種屬。