嵌合抗原受體 (CAR) 在 T 細胞上的表達將患者的細胞轉(zhuǎn)化為基于細胞的癌癥療法，并徹底改變了當(dāng)今的癌癥治療格局。盡管這項技術(shù)取得了成功，并獲得了業(yè)界的積極響應(yīng)，但市場對于借助 CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)實現(xiàn)更復(fù)雜基因工程的需求日益高漲。復(fù)雜基因工程的應(yīng)用包括：破壞腫瘤微環(huán)境所利用的抑制途徑、提高 CAR T 細胞的效率^4,5和使用同種異體供體生產(chǎn)通用 CAR T 細胞。業(yè)界迫切希望在下一代 T 細胞療法中同時實現(xiàn)基因編輯和轉(zhuǎn)基因表達，這凸顯了在細胞功能、細胞產(chǎn)量、生產(chǎn)簡化和放大工藝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的遺傳物質(zhì)遞送方法的重要性。

一種有前景的新型 T 細胞工程方法是，使用 RNA 來表達治療性蛋白質(zhì)和基因編輯核酸酶。RNA 通常通過電穿孔遞送至細胞，但在多步基因工程中使用連續(xù)電脈沖時，需要在效率和細胞活力之間進行仔細權(quán)衡。而脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 則無需進行這種權(quán)衡，使其成為一種具有吸引力的 RNA 遞送替代方法。LNP 是完全合成的脂質(zhì)配方，用于在將 RNA 遞送到細胞之前對其進行包封和保護。目前，LNP 的生產(chǎn)已經(jīng)成熟，并且可放大用于大規(guī)模基因遞送和基因編輯，而這是滿足當(dāng)下和未來臨床需求的關(guān)鍵。RNA-LNP 復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上與低密度脂蛋白 (LDL) 類似，并可以利用 LDL 的內(nèi)源性攝取途徑，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞。這種溫和的攝取機制能夠成功地進行 T 細胞基因工程，同時保持高細胞活力。

在本文中，我們報告了一種使用 GenVoy-ILM^™ T Cell Kit for mRNA 對 T 細胞進行連續(xù)基因工程的新型方法。我們利用優(yōu)化的生產(chǎn)工作流程來遞送各種RNA（圖 1）。在本案例研究中，我們介紹了 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 T 細胞受體 (TCRɑβ) 敲除 (KO) 技術(shù)，并探討了使用多步 LNP 工程（一種有前景的同種異體 CAR T 細胞療法）來產(chǎn)生 TCRɑβ KO CAR T 細胞。我們還詳細描述了 LNP 生產(chǎn)和細胞培養(yǎng)處理方案，以及 T 細胞基因編輯的優(yōu)化策略，以確保使用 GenVoy-ILM T Cell Kit for mRNA 成功進行基因工程。

圖 1.使用脂質(zhì)納米顆粒對人類

原代 T細胞進行基因編輯。

基因敲除是通過遞送 Cas9 mRNA 和合成向?qū)�RNA (sgRNA) 實現(xiàn)的。在遞送和翻譯后，Cas9 蛋白和 sgRNA 在細胞內(nèi)結(jié)合，并穿梭到細胞核中進行靶基因的雙鏈斷裂。如果沒有 DNA 供體模板，絕大多數(shù)斷裂會通過易突變的非同源末端連接 (NHEJ) 進行結(jié)合，從而永久性敲除靶蛋白。

原代 T 細胞的基因編輯可以通過許多酶來實現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶 (TALEN)、鋅指核酸酶 (ZFN) 和成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列 (CRISPR) Cas9。其中，CRISPR/Cas9 因易于進行靶標(biāo)選擇和優(yōu)化而越來越受歡迎。在 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯中，Cas9 蛋白通過向?qū)�RNA被導(dǎo)向靶DNA，并誘導(dǎo)雙鏈斷裂，這些斷裂大多通過非同源末端連接 (NHEJ) 修復(fù)。RNA 導(dǎo)向的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠靈活地進行靶標(biāo)選擇和多重基因編輯，為 CAR T 細胞治療創(chuàng)造了巨大的潛力

傳統(tǒng)上，病毒載體用于 T 細胞工程，但存在幾個限制，包括有限的包載量、不良免疫反應(yīng)和高生產(chǎn)成本。為了避免病毒載體的這些缺點，電穿孔的使用日益普及；然而，如上所述，同時實現(xiàn)基因編輯和蛋白質(zhì)表達所需的連續(xù)電脈沖可能對細胞有害。這會降低細胞活力和產(chǎn)量，造成基因失調(diào)，并增加細胞衰竭標(biāo)記基因的表達。

盡管 LNP 相關(guān)研究的數(shù)量有限，但 Billingsley 等人的兩項近期研究表明，與電穿孔和/或慢病毒轉(zhuǎn)染相比，原代 T 細胞中 LNP 介導(dǎo)的 CD19 CAR mRNA 表達具有同等的腫瘤殺傷效力。

GenVoy-ILM^™ T Cell Kit for mRNA 提供了一種臨床相關(guān)、可放大的 LNP 基因編輯方法，以推進細胞治療領(lǐng)域的發(fā)展，其利用的LNP技術(shù)也是變革新冠肺炎mRNA疫苗開發(fā)工作的強大技術(shù)。這項工作旨在展示 LNP 在治療性蛋白表達和先進 T 細胞工程中的強大作用。我們對用于包封商用 Cas9 mRNA 和向?qū)?RNA (sgRNA) 的 LNP 的封裝、包載比率和多導(dǎo)向組合進行了優(yōu)化。此外，我們展示了 LNP 可以無縫整合到標(biāo)準(zhǔn)原代 T 細胞培養(yǎng)工作流程中，以及多次 LNP 添加如何產(chǎn)生基因編輯的 CAR T 細胞。借助 NanoAssmblr^® Spark^™ 微流控平臺，這些研發(fā)規(guī)模的 RNA-LNP 在不到 5 分鐘的時間內(nèi)產(chǎn)生，并直接添加到細胞中。

這項工作表明，使用 GenVoy-ILM T Cell Kit for mRNA 生產(chǎn)的 LNP 能夠高效地進行靶標(biāo)敲除（兩個 sgRNA 為 80 ± 8%）和 CAR 蛋白表達 (91 ± 5%)，同時保持高細胞活力 (> 90%)。所得的基因編輯 CAR T 細胞與白血病細胞共培養(yǎng)，并顯示出高效的靶標(biāo)特異性殺傷作用，而基因編輯本身對治療潛力沒有負面影響。

圖 2.原代 T 細胞基因編輯和多步工程工作流程。

第 1 天 - 解凍并活化凍存的人類原代 Pan T 細胞。第 1-4 天 – 生產(chǎn) LNP，評估 RNA 包封效率以確定劑量。第 4 天 - 活化的 T 細胞與基因編輯 RNA-LNP 一起孵育。第 4-11 天 - 細胞擴增以增加細胞數(shù)量用于隨后的實驗。第 13 天 - 用 CAR mRNA-LNP 處理基因編輯細胞，表達治療性抗 CD19 CAR 蛋白。第 14 天 – CAR 處理后約 24 小時，進行針對腫瘤靶標(biāo)的細胞毒性試驗。
 

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