Morris水迷宮實驗設(shè)計時應(yīng)考慮的影響因素
Morris水迷宮是利用小鼠尋找水中的休息場所的本能，通過定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分來測 試小鼠對空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力。在實驗過程中注意事項不容忽視，只有注意這些外部因素， 才能使實驗不受影響順利進(jìn)行，而且實驗數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。
一.水池尺寸
最常見的問題是使用了一個不合適的水池尺寸，從而到平臺的距離不合適。許多水池都太小了，或者是處于評估空間學(xué)習(xí)最佳任務(wù)的尺寸下限。更小的水池會導(dǎo)致動物使用其他策略（比如從水池壁游一個固定的距離）來解決任務(wù)，同時最少地使用遠(yuǎn)端線索。值得注意的是，如果水池太小，動物通過其他策略找到平臺，但實驗者不會意識到動物正在使用非遠(yuǎn)端線索來找到平臺，這樣就難以發(fā)現(xiàn)問題。因此，從一開始就選擇合適的水池大小是獲得有效空間學(xué)習(xí)的最佳方法。
使用未經(jīng)任何處理的成年、雄性、Long–Evans大鼠，觀察水池大小對任務(wù)表現(xiàn)的影響如圖一所示。
小水池直徑122厘米，大水池直徑210厘米。兩組的水溫相同，平臺大小（10 cm2）也相同。兩組在同一個房間同樣的天數(shù)相同的目標(biāo)位置相同的順序接受相同的試驗次數(shù)（每天4次）。水池的建造和油漆都是一樣的，唯一的區(qū)別是直徑。對于小水池試驗，較小的水池被放置在大水池內(nèi)�？梢钥闯觯∷亟M對任務(wù)學(xué)習(xí)得很好；但事實上，他們學(xué)得如此之快，以至于幾乎沒有學(xué)習(xí)曲線。基本上，小水池組在第二天就接近穩(wěn)定表現(xiàn)。相比之下，大水池組在前四天任務(wù)學(xué)習(xí)方面表現(xiàn)出穩(wěn)步提高，并在第5天達(dá)到穩(wěn)定表現(xiàn)。很明顯哪條曲線更適合評估學(xué)習(xí)。因此，不推薦122厘米的水池用于大鼠，可以選擇210厘米的大水池。
另一方面，122厘米的水池是小鼠最常見的尺寸。轉(zhuǎn)基因、敲除和敲入小鼠在MWM中都進(jìn)行了常規(guī)評估。有大量的數(shù)據(jù)表明，在小鼠中，使用一個直徑為122厘米的水池可以獲得良好的學(xué)習(xí)曲線。這可能是因為這個大小的水池更適合小鼠的體型，或者因為小鼠進(jìn)行空間任務(wù)比大鼠更困難，因此，一個更小的搜索區(qū)域是有利于任務(wù)學(xué)習(xí)的。
二.水池設(shè)計
商業(yè)購買的水迷宮應(yīng)仔細(xì)溝通設(shè)計細(xì)節(jié)，因為它們通常具有突出的焊縫、波紋表面或提供近端線索的其他特征，如水箱內(nèi)部的標(biāo)記。這些線索破壞了任務(wù)的研究目的，因為目的是測試動物使用遠(yuǎn)端線索導(dǎo)航的能力。一個專業(yè)的迷宮要實現(xiàn)不顯眼的接縫和統(tǒng)一的內(nèi)部。光滑的內(nèi)壁還可以最大限度地減少動物在早期試驗中攀爬池壁的嘗試。
三. 動物品系
不同的小鼠品系在MWM測試中的表現(xiàn)差異很大。其中一種表現(xiàn)相當(dāng)好的品系是C57BL。無論什么供應(yīng)商，C57BL小鼠都是相當(dāng)好的游泳高手，并且放置在水中后有適當(dāng)?shù)挠斡舅阉鞣磻?yīng)。有些品系放進(jìn)水中會漂浮或轉(zhuǎn)圈，則不能使用。C57BL在MWM中任務(wù)學(xué)習(xí)的研究結(jié)果是一致的，但各實驗室對其他品系小鼠的報告則有所不同。例如，經(jīng)常進(jìn)行基因靶向的129S品系，其在水中漂浮和不穩(wěn)定表現(xiàn)的發(fā)生率較高，但這也要區(qū)分亞系，因為據(jù)報道，129S2/SvlmJ小鼠在MWM中的表現(xiàn)令人滿意。BALB小鼠在MWM中有的表現(xiàn)良好，有的則表現(xiàn)不佳。
一項旨在在多個小鼠品系和大量小鼠（～1,500只）中進(jìn)行MWM學(xué)習(xí)的聚類決定因素的因素分析表明，有三個因素解釋了MWM表現(xiàn)的大部分差異。最大的因素（48%）被稱為趨觸性（thigmotaxis），代表了在水池壁附近游動或漂浮的傾向。第二大因素（20%）被稱為被動性（passivity），代表游泳緩慢或不游泳。第三個因素是記憶或目標(biāo)導(dǎo)向的行為（13%）。這種分析的結(jié)果是所測量因素的函數(shù)，因此不同的測量將產(chǎn)生不同的因素分析。盡管如此，這項分析包括了MWM表現(xiàn)的許多重要變量，表明表現(xiàn)的差異很大程度上是由于與小鼠學(xué)習(xí)和記憶無關(guān)的因素造成的，因此在小鼠研究中使用適當(dāng)?shù)膶φ諏Y(jié)果的正確解釋尤為重要。
在大鼠中，白化品系Sprague–Dawley, Wistar, Fischer 344和 Lewis大鼠，色素沉著品系如 Long–Evans 和Lister都被證明可以很好的學(xué)習(xí)空間位置。
四.非執(zhí)行者
在大鼠中很少見到不執(zhí)行任務(wù)的動物，但在小鼠中卻有這種情況。與大多數(shù)其他品系相比，MWM中的非執(zhí)行者中在C57BL小鼠中更少見。然而，一些基因修飾可能導(dǎo)致突變動物無法完成這項任務(wù)，這種情況相對常見。然而，由于研究目標(biāo)就是進(jìn)行的遺傳操縱，有一部分小鼠不尋找目標(biāo)，這種情況發(fā)生的頻率很高。在這種情況下，問題就變成了如何處理這種情況。最常見的表現(xiàn)是，一些小鼠漂浮著，似乎沒有逃避的動力。
目前已經(jīng)嘗試了不同的方法來誘導(dǎo)非執(zhí)行者游泳，但這些方法通常需要實驗者的干預(yù)，例如用很大的聲音驚動小鼠，用物體戳它，或者預(yù)先弄濕皮毛以減少浮力（小鼠之所以能浮起來，是因為它們的皮毛含有防水油，可以讓它們一次漂浮幾分鐘。在20–22 ℃的水中測試小鼠通常會降低漂浮的頻率）。盡管如此，在考慮實驗者干預(yù)時應(yīng)謹(jǐn)慎。因為，干預(yù)措施很難做到完全客觀一致，可能會無意中引入偏倚。如果實驗組的漂浮頻率較高或較低，或者實驗處理因素與驚嚇或其他因素相互作用，結(jié)果解釋可能會混淆。更好的方法是使用不涉及干預(yù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則。
有的研究者采用的方法是，如果一只小鼠漂浮，就讓它在水中停留，最大時間到試驗的規(guī)定時間。如果它一直沒有游泳，則將其移走，并對下一只動物進(jìn)行測試。當(dāng)一組中的其他動物完成后，對該漂浮者小鼠進(jìn)行第二次試驗。如果這次它游泳了，它就繼續(xù)接受完整的試驗序列，排除掉第一次的試驗數(shù)據(jù)。如果它在第二次試驗中也漂浮，則將它送回籠子，第二天再次進(jìn)行試驗。如果它第二天游泳了，則它可以繼續(xù)測試，不過是落后于它的同伴一天。如果它依然不能游泳，將它退出測試順序，直到今天其他動物完成測試，然后對這只小鼠進(jìn)行最后一次測試。如果它在第四次嘗試中未能游泳，則將它從實驗中移除。在實驗結(jié)束時，對每組中漂浮者的頻率進(jìn)行統(tǒng)計比較，以確定與野生型相比，實驗操作是否顯著改變了非執(zhí)行者的頻率。如果是這樣的話，那么必須根據(jù)選擇偏差的可能性謹(jǐn)慎地解釋數(shù)據(jù)。
五.總結(jié)
總之，硬件設(shè)施和實驗動物的年齡、性別、品系差異均影響MWM任務(wù)表現(xiàn)。研究表明，老年小鼠在MWM中表現(xiàn)較差。雄性嚙齒動物表現(xiàn)優(yōu)于雌性；此外，小鼠的漂浮情況比大鼠更明顯。因此，在測試前要保證這些因素在各組是均一的。證據(jù)還表明，應(yīng)激動物在MWM中表現(xiàn)更差，因此，應(yīng)監(jiān)測可能導(dǎo)致應(yīng)激的環(huán)境因素，如溫度、光照和噪聲，并在整個任務(wù)中保持這些非實驗因素恒定。
一.水池尺寸
最常見的問題是使用了一個不合適的水池尺寸，從而到平臺的距離不合適。許多水池都太小了，或者是處于評估空間學(xué)習(xí)最佳任務(wù)的尺寸下限。更小的水池會導(dǎo)致動物使用其他策略（比如從水池壁游一個固定的距離）來解決任務(wù)，同時最少地使用遠(yuǎn)端線索。值得注意的是，如果水池太小，動物通過其他策略找到平臺，但實驗者不會意識到動物正在使用非遠(yuǎn)端線索來找到平臺，這樣就難以發(fā)現(xiàn)問題。因此，從一開始就選擇合適的水池大小是獲得有效空間學(xué)習(xí)的最佳方法。
使用未經(jīng)任何處理的成年、雄性、Long–Evans大鼠，觀察水池大小對任務(wù)表現(xiàn)的影響如圖一所示。
另一方面，122厘米的水池是小鼠最常見的尺寸。轉(zhuǎn)基因、敲除和敲入小鼠在MWM中都進(jìn)行了常規(guī)評估。有大量的數(shù)據(jù)表明，在小鼠中，使用一個直徑為122厘米的水池可以獲得良好的學(xué)習(xí)曲線。這可能是因為這個大小的水池更適合小鼠的體型，或者因為小鼠進(jìn)行空間任務(wù)比大鼠更困難，因此，一個更小的搜索區(qū)域是有利于任務(wù)學(xué)習(xí)的。
二.水池設(shè)計
商業(yè)購買的水迷宮應(yīng)仔細(xì)溝通設(shè)計細(xì)節(jié)，因為它們通常具有突出的焊縫、波紋表面或提供近端線索的其他特征，如水箱內(nèi)部的標(biāo)記。這些線索破壞了任務(wù)的研究目的，因為目的是測試動物使用遠(yuǎn)端線索導(dǎo)航的能力。一個專業(yè)的迷宮要實現(xiàn)不顯眼的接縫和統(tǒng)一的內(nèi)部。光滑的內(nèi)壁還可以最大限度地減少動物在早期試驗中攀爬池壁的嘗試。
不同的小鼠品系在MWM測試中的表現(xiàn)差異很大。其中一種表現(xiàn)相當(dāng)好的品系是C57BL。無論什么供應(yīng)商，C57BL小鼠都是相當(dāng)好的游泳高手，并且放置在水中后有適當(dāng)?shù)挠斡舅阉鞣磻?yīng)。有些品系放進(jìn)水中會漂浮或轉(zhuǎn)圈，則不能使用。C57BL在MWM中任務(wù)學(xué)習(xí)的研究結(jié)果是一致的，但各實驗室對其他品系小鼠的報告則有所不同。例如，經(jīng)常進(jìn)行基因靶向的129S品系，其在水中漂浮和不穩(wěn)定表現(xiàn)的發(fā)生率較高，但這也要區(qū)分亞系，因為據(jù)報道，129S2/SvlmJ小鼠在MWM中的表現(xiàn)令人滿意。BALB小鼠在MWM中有的表現(xiàn)良好，有的則表現(xiàn)不佳。
在大鼠中，白化品系Sprague–Dawley, Wistar, Fischer 344和 Lewis大鼠，色素沉著品系如 Long–Evans 和Lister都被證明可以很好的學(xué)習(xí)空間位置。
四.非執(zhí)行者
在大鼠中很少見到不執(zhí)行任務(wù)的動物，但在小鼠中卻有這種情況。與大多數(shù)其他品系相比，MWM中的非執(zhí)行者中在C57BL小鼠中更少見。然而，一些基因修飾可能導(dǎo)致突變動物無法完成這項任務(wù)，這種情況相對常見。然而，由于研究目標(biāo)就是進(jìn)行的遺傳操縱，有一部分小鼠不尋找目標(biāo)，這種情況發(fā)生的頻率很高。在這種情況下，問題就變成了如何處理這種情況。最常見的表現(xiàn)是，一些小鼠漂浮著，似乎沒有逃避的動力。
目前已經(jīng)嘗試了不同的方法來誘導(dǎo)非執(zhí)行者游泳，但這些方法通常需要實驗者的干預(yù)，例如用很大的聲音驚動小鼠，用物體戳它，或者預(yù)先弄濕皮毛以減少浮力（小鼠之所以能浮起來，是因為它們的皮毛含有防水油，可以讓它們一次漂浮幾分鐘。在20–22 ℃的水中測試小鼠通常會降低漂浮的頻率）。盡管如此，在考慮實驗者干預(yù)時應(yīng)謹(jǐn)慎。因為，干預(yù)措施很難做到完全客觀一致，可能會無意中引入偏倚。如果實驗組的漂浮頻率較高或較低，或者實驗處理因素與驚嚇或其他因素相互作用，結(jié)果解釋可能會混淆。更好的方法是使用不涉及干預(yù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則。
有的研究者采用的方法是，如果一只小鼠漂浮，就讓它在水中停留，最大時間到試驗的規(guī)定時間。如果它一直沒有游泳，則將其移走，并對下一只動物進(jìn)行測試。當(dāng)一組中的其他動物完成后，對該漂浮者小鼠進(jìn)行第二次試驗。如果這次它游泳了，它就繼續(xù)接受完整的試驗序列，排除掉第一次的試驗數(shù)據(jù)。如果它在第二次試驗中也漂浮，則將它送回籠子，第二天再次進(jìn)行試驗。如果它第二天游泳了，則它可以繼續(xù)測試，不過是落后于它的同伴一天。如果它依然不能游泳，將它退出測試順序，直到今天其他動物完成測試，然后對這只小鼠進(jìn)行最后一次測試。如果它在第四次嘗試中未能游泳，則將它從實驗中移除。在實驗結(jié)束時，對每組中漂浮者的頻率進(jìn)行統(tǒng)計比較，以確定與野生型相比，實驗操作是否顯著改變了非執(zhí)行者的頻率。如果是這樣的話，那么必須根據(jù)選擇偏差的可能性謹(jǐn)慎地解釋數(shù)據(jù)。
五.總結(jié)
總之，硬件設(shè)施和實驗動物的年齡、性別、品系差異均影響MWM任務(wù)表現(xiàn)。研究表明，老年小鼠在MWM中表現(xiàn)較差。雄性嚙齒動物表現(xiàn)優(yōu)于雌性；此外，小鼠的漂浮情況比大鼠更明顯。因此，在測試前要保證這些因素在各組是均一的。證據(jù)還表明，應(yīng)激動物在MWM中表現(xiàn)更差，因此，應(yīng)監(jiān)測可能導(dǎo)致應(yīng)激的環(huán)境因素，如溫度、光照和噪聲，并在整個任務(wù)中保持這些非實驗因素恒定。
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