包括乳腺在內(nèi)的許多器官的樹(shù)狀結(jié)構(gòu)是通過(guò)分支形態(tài)發(fā)生（branching morphogenesis）過(guò)程形成的。分支形態(tài)發(fā)生是一個(gè)原有上皮細(xì)胞發(fā)生分支并侵入的重復(fù)過(guò)程。為探究是什么因素決定著分支形態(tài)發(fā)生起始的位點(diǎn)，美國(guó)勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的研究人員Celeste M. Nelson等通過(guò)凝膠鑄模的方法，使用小鼠乳腺上皮（EpH4）細(xì)胞構(gòu)建了可控制初始幾何形態(tài)的乳腺上皮小管3D模型，并結(jié)合算法對(duì)分支情況進(jìn)行量化，發(fā)現(xiàn)小管的幾何形態(tài)能夠決定分支起始的位置。研究進(jìn)一步證實(shí)了分支起始于自分泌型抑制形態(tài)發(fā)生子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growthfactor–β, TGFβ）局部濃度最小的部位。而組織的幾何形態(tài)又能夠影響局部細(xì)胞微環(huán)境，從而控制形態(tài)發(fā)生。該成果以“Tissue GeometryDetermines Sites of Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic Cultures”為題發(fā)表于Science雜志。

研究背景

       乳腺上皮小管雛形在個(gè)體出生時(shí)就已存在，但在青春期會(huì)突然出現(xiàn)分叉和側(cè)向分支，由此從乳腺上皮小管雛形轉(zhuǎn)變?yōu)槌赡甏菩园l(fā)育完全的乳腺導(dǎo)管樹(shù)。該過(guò)程中的分支形態(tài)發(fā)生受到許多因素的調(diào)節(jié)，包括生長(zhǎng)因子（growth factors）、細(xì)胞外基質(zhì)分子（extracellular matrix）、蛋白酶（proteases）和形態(tài)發(fā)生子（morphogens）。這些因子必須在發(fā)生分支的組織中整合并綜合作用，以確定分支起始的位置，確定一組上皮細(xì)胞是否要形成分支或分叉。目前在肺、腎和唾液腺等許多器官中針對(duì)這一過(guò)程的研究，已經(jīng)有很多技術(shù)方法，但關(guān)于分支起始的空間位置是如何決定的，目前還無(wú)法進(jìn)行精確的量化分析�？紤]到乳腺導(dǎo)管網(wǎng)絡(luò)是從已有的上皮小管分支出來(lái)，研究人員假設(shè)上皮小管內(nèi)細(xì)胞的位置可能對(duì)起始分支位點(diǎn)有一定的決定作用，并對(duì)此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織的形態(tài)和環(huán)境，包括多細(xì)胞小管的幾何形狀，以及它們與臨近小管的接近程度，都能影響分支發(fā)生的位置。

結(jié)果與討論

       研究人員開(kāi)發(fā)了一種三維（3D）微模型，即將功能正常的小鼠乳腺上皮（EpH4）細(xì)胞包埋在特定形狀的膠原凝膠空腔中，構(gòu)建出特定幾何形態(tài)的乳腺上皮小管，進(jìn)而通過(guò)控制小管的初始幾何形態(tài)來(lái)模擬乳腺雛形，并量化它們發(fā)生分支的位置。上述膠原凝膠空腔是使用未聚合的膠原I（collagen I）和彈性“印章”（stamp）鑄模產(chǎn)生的（圖1A）。包埋于凝膠空腔中的上皮細(xì)胞能夠貼合空腔大小和形狀形成中空小管（圖1，B和C）。為量化分支情況并從統(tǒng)計(jì)學(xué)上表示出大小和位置，研究人員對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并將多個(gè)熒光圖像堆疊以顯示出小管內(nèi)和從小管分支的細(xì)胞的平均空間分布（圖1D），并將圖像圖像堆疊制成分布頻率圖（圖1E）。構(gòu)建的小管模型形成正確極化的雙層小管，即由肌上皮細(xì)胞和基底膜包圍著一層內(nèi)腔上皮細(xì)胞（圖1H）。

       添加表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）（圖1F）小管進(jìn)行分支形態(tài)發(fā)生。誘導(dǎo)后24小時(shí)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有多細(xì)胞分支延伸到周圍的膠原基質(zhì)中，且這些分支只從小管末端開(kāi)始，并不從側(cè)面開(kāi)始（圖1，F(xiàn)和G）。這一模式與體內(nèi)乳腺頂芽的二分支類似。

       細(xì)胞必須發(fā)生變形并侵入周圍的組織以啟動(dòng)分支發(fā)生。已知乳腺和腎臟3D培養(yǎng)過(guò)程中，上皮細(xì)胞在侵入周圍細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，分支尖端會(huì)經(jīng)歷短暫的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-tomesenchymaltransition, EMT），該過(guò)程會(huì)修飾細(xì)胞表達(dá)的粘附分子，從而使其具有遷移和侵襲性行為。由于凝膠模型系統(tǒng)能夠較為確定地（96-99%）預(yù)測(cè)分支的位置。于是研究人員對(duì)遷移相關(guān)的波形蛋白基因啟動(dòng)子調(diào)控綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)原位分析，發(fā)現(xiàn)在隨后會(huì)發(fā)生分支的位置的細(xì)胞中，這種侵襲性間充質(zhì)表型會(huì)被特異性激活（圖1，J和K）。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)阻斷乳腺分支形態(tài)發(fā)生侵襲過(guò)程所需的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases, MMPs）和間充質(zhì)來(lái)源的形態(tài)發(fā)生子如表皮形態(tài)發(fā)生素（epimorphin）的活性，會(huì)阻斷小管分支，但并不會(huì)阻止波形蛋白基因啟動(dòng)子的激活（圖S2）。這些數(shù)據(jù)表明在分支延伸之前，侵襲性表型被限制在一定空間內(nèi)，細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谛」軆?nèi)的位置決定是否進(jìn)行分支。

圖1。構(gòu)建的乳腺上皮小管的形成的分支的特征。A為構(gòu)建3D小管模型的示意圖。B為誘導(dǎo)分支前小管的相位襯度圖像。C為誘導(dǎo)分支前小管細(xì)胞actin（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的共聚焦圖像。D為將50張小管細(xì)胞核的圖像進(jìn)行堆疊。E為堆疊產(chǎn)生的誘導(dǎo)分支前的細(xì)胞分布頻率圖。F和G分別為加入EGF誘導(dǎo)分支24小時(shí)后，小管的相位襯度圖和頻率圖。H為小管中上皮角蛋白-8（綠色）、肌上皮角蛋白-14（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）進(jìn)行染色，得到的共聚焦圖像；插圖Z型截面。I為添加EGF24小時(shí)后小管的分布頻率圖。J為添加EGF8小時(shí)后，波形蛋白基因啟動(dòng)子-GFP（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的熒光圖像。K為添加EGF8小時(shí)后，波形蛋白基因啟動(dòng)子-GFP的表達(dá)頻率圖。比例尺50μm。

       通過(guò)檢查不同幾何形態(tài)小管的形態(tài)發(fā)生過(guò)程，研究人員發(fā)現(xiàn)增加小管長(zhǎng)度會(huì)使分支增加，但細(xì)胞仍然只從末端進(jìn)行分支。彎曲的小管優(yōu)先從曲線的凸面分支（圖2A）。分叉小管和樹(shù)形結(jié)構(gòu)中也觀察到不對(duì)稱分支（圖2，B和C），優(yōu)先從遠(yuǎn)端位置分支。且分支需要細(xì)胞增殖，但并不是于增殖或生長(zhǎng)因子受體的局部增強(qiáng)信號(hào)而導(dǎo)致分支發(fā)生。

       有研究發(fā)現(xiàn)，分支形態(tài)發(fā)生的位置可能由鄰近間充質(zhì)組織分泌的刺激性形態(tài)發(fā)生子有關(guān)，可作為上皮分支的化學(xué)引誘劑。但遠(yuǎn)端釋放誘導(dǎo)信號(hào)如外源添加EGF，又可能被上皮細(xì)胞局部釋放的抑制信號(hào)平衡掉。因此在小管上皮細(xì)胞自分泌抑制因子局部濃度最小或閾值濃度以下的位置，就可能是分支發(fā)生的位置。

       實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的小管內(nèi)的上皮細(xì)胞在沒(méi)有相鄰間充質(zhì)細(xì)胞的情況下表現(xiàn)出模式化行為，因此需要驗(yàn)證這種假設(shè)。研究人員整理了各種形態(tài)下抑制因子的濃度，發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定狀態(tài)下每個(gè)小管周圍都發(fā)現(xiàn)了抑制因子形成的濃度梯度（圖2，D、E、F），而且在誘導(dǎo)分支的位置，抑制因子的濃度最低。

圖2。分支位置由小管的幾何形態(tài)決定，并與分泌型擴(kuò)散抑制因子的濃度分布相關(guān)。A和B 分別為誘導(dǎo)分支24小時(shí)后，彎曲小管和分叉小管的分布頻率圖。C為分形樹(shù)的actin（紅色）和細(xì)胞核（綠色）免疫熒光染色圖。箭頭所示為分支位點(diǎn)。D、E和F分別為彎曲小管、分叉小管和分形樹(shù)的可擴(kuò)散抑制因子的濃度分布。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的抑制因子局部濃度最低的位置就是誘導(dǎo)發(fā)生分支的位置。比例尺50μm。

       研究人員還探究了增加抑制因子的局部濃度是否足以阻斷小管末端的分支。通過(guò)減小小管之間的距離（圖3，A和B）發(fā)現(xiàn)，分支發(fā)生在遠(yuǎn)端的小管末端，相鄰近的末端并不分支（圖3，C和D）。在約75μm距離內(nèi)，小管分支都會(huì)受到抑制。已知在小鼠乳腺中也發(fā)現(xiàn)了類似的導(dǎo)管間距。因此組織的初始幾何形態(tài)變化也會(huì)通過(guò)影響抑制因子的濃度分布來(lái)改變分支發(fā)生的位置。

圖3。分支的位置可以通過(guò)抑制因子濃度分布來(lái)預(yù)測(cè)。A和B分別為相互垂直和平行方位下，小管周圍擴(kuò)散性抑制因子濃度分布。C和D為誘導(dǎo)分支24小時(shí)后的分支頻率圖，表明高濃度抑制因子的區(qū)域，分支受到抑制。比例尺50μm。

       已知許多蛋白會(huì)抑制體內(nèi)乳腺分支的形態(tài)發(fā)生，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ），它通過(guò)I型Ⅱ型受體形成的四聚體復(fù)合物發(fā)出信號(hào)。本研究中構(gòu)建的小管也能夠表達(dá)TGFβ及其受體，免疫熒光染色顯示TGFβ1的濃度梯度與我們的數(shù)值預(yù)測(cè)相關(guān)（圖4A）�；钚訲GFβ1過(guò)表達(dá)會(huì)完全抑制分支（圖4，B和C）。為確定TGFβ是否在該系統(tǒng)中作為內(nèi)源性抑制劑，研究人員使用三種方法阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)：抗TGFβ1功能阻斷抗體處理；用TGFβ Ⅰ型受體激酶活性制劑處理；顯性陰性TGFβ Ⅱ型受體過(guò)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有阻斷處理都會(huì)使整個(gè)小管上出現(xiàn)均勻的分支現(xiàn)象（圖4，D和E，以及圖S6）。

圖4。抑制活性部分由自分泌的TGFβ介導(dǎo)。A為小管模型的共聚焦切片，對(duì)TGFβ1進(jìn)行染色，圖示沿小管（紅色）和遠(yuǎn)離小管（綠色），相對(duì)像素強(qiáng)度和距離的函數(shù)。藍(lán)色曲線為預(yù)測(cè)曲線。B和C分別為誘導(dǎo)分支24小時(shí)后，對(duì)照小管和過(guò)表達(dá)TGFβ1小管的分布頻率圖，證明TGFβ1能夠抑制分支。D和E表明阻斷內(nèi)源性TGFβ1信號(hào)會(huì)擾亂分支的位置控制，分別為載體對(duì)照細(xì)胞和過(guò)表達(dá)顯性負(fù)型TGFβ受體Ⅱ型（HA-DNTβRⅡ）的細(xì)胞，對(duì)應(yīng)小管誘導(dǎo)分支24小時(shí)后的分布頻率圖。比例尺50μm。

全文總結(jié)

       本文用一種簡(jiǎn)單離體系統(tǒng)，使構(gòu)建的乳腺上皮小管也能表現(xiàn)出復(fù)雜的分支和側(cè)向分支行為，因此在體內(nèi)，導(dǎo)管的幾何形態(tài)也會(huì)影響形態(tài)發(fā)生過(guò)程。該機(jī)制可能幫助我們理解乳腺在發(fā)育過(guò)程中是如何實(shí)現(xiàn)開(kāi)放結(jié)構(gòu)的。已知分支形態(tài)發(fā)生的位置至少有一部分是由乳腺和其他分支器官所分泌的抑制性形態(tài)發(fā)生子如TGFβ的局部濃度決定�？紤]到TGFβ以非活性的潛伏形式分泌，且研究發(fā)現(xiàn)野生型過(guò)量表達(dá)的TGFβ1并不會(huì)影響分支，因此可能還需要其他信號(hào)參與決定分支位置的抑制活性的濃度分布。已知基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑（TIMPs）會(huì)影響分支�？紤]到細(xì)胞間的張力可以改變細(xì)胞對(duì)形態(tài)發(fā)生子的反應(yīng)或形態(tài)發(fā)生子本身的活性，因此發(fā)揮作用可能是化學(xué)信號(hào)也可能是機(jī)械信號(hào)。

       很久以前就有許多理論科學(xué)家提出過(guò)假設(shè)，組織發(fā)育模式可能與刺激型和抑制型形態(tài)發(fā)生子濃度梯度之間的平衡機(jī)制有關(guān)。本研究使用的凝膠模型系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)直接定量測(cè)試這些因素在相關(guān)發(fā)育環(huán)境中的位置整合情況，并可以擴(kuò)展用于研究控制任何分支器官系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：
Nelson, Celeste M , VanDuijn, et al. Tissue Geometry Determines Sites of Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic CUltures.[J]. Science, 2006.