腸道微生物群的組成與腫瘤的發(fā)展和抗腫瘤免疫的功效有關。匹茲堡大學醫(yī)學院Timothy Hand教授研究團隊在Immunity (31.428)雜志上發(fā)表了一篇研究論文，名為“Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer”，揭示了帶有免疫原性腸道細菌肝螺桿菌（Hhep）定殖結腸腫瘤小鼠，誘導Hhep特異性T濾泡輔助細胞和腫瘤鄰近的三級淋巴結構（TLSs）擴張，從而促進抗腫瘤免疫。
研究材料
AOM-DSS模型鼠、AOM-DSS+Hhep小鼠

技術路線
· 步驟1：表型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Hhep定殖介導了結腸癌中強大的抗腫瘤作用；
· 步驟2：單細胞轉錄組分析揭示Hhep定殖增加細胞毒性淋巴細胞的腫瘤浸潤并促使TLSs的擴張；
· 步驟3：Tfh 細胞是 Hhep 介導的腫瘤控制和免疫浸潤所必需的。

研究結果
1. Hhep定殖重塑結直腸癌腫瘤微環(huán)境
前人的研究表明，Hhep菌（一種具有內在免疫原性的腸道細菌）定殖荷瘤小鼠引發(fā)的特異性免疫反應可修飾結腸癌微生物群結構，導致抗腫瘤免疫增強。本研究，作者將Hhep菌定殖于生長7周的結直腸癌（CRC）小鼠模型中，相對于對照組（荷瘤小鼠無Hhep菌定殖），Hhep定殖顯著減少了腫瘤的數(shù)量和大小，延長了小鼠的生存周期。同時，Hhep定殖對腫瘤小鼠的腸道微生物群產(chǎn)生影響，以及腫瘤的免疫細胞浸潤增加。以上結果表明，Hhep定殖介導了結腸癌中強大的抗腫瘤作用。
2. Hhep驅動的抗腫瘤免疫
為了更全面的了解Hhep定殖對CRC TME的影響，作者對腫瘤上皮層細胞（epithelial layer,EL）進行單細胞轉錄組測序，共鑒定出12個細胞簇，Hhep定殖誘導了細胞毒性淋巴細胞（簇1）和效應T細胞（簇5）的增加。其中細胞毒性淋巴細胞包含多種不同的NK細胞和T細胞（CD8⁺、CD4⁺），表達與細胞毒性功能相關的基因（Gzma）。以上數(shù)據(jù)表明，Hhep定殖增加細胞毒性淋巴細胞的腫瘤浸潤。
3. Hhep定殖促使TLSs擴張
前人的研究表明，Hhep特異性CD4⁺T細胞主要在結腸固有層（ lamina propria,LP）中積累（Chai et al., 2017; Xu et al., 2018），因此作者利用單細胞轉錄組測序分析了Hhep定殖對LP的影響。聚類分析揭示了表達與基質和內皮細胞相關基因的細胞（簇 1、5、9 和 13）的富集，特別是 Hhep 定殖小鼠中 Ccl21a⁺Lyve1⁺ 淋巴管簇（簇 9、子簇 2）的增加。同時，作者觀察到 LP 中淋巴管生成所需基因（Pdpn，Vegfc）的頻率增加，熒光顯微鏡顯示 Lyve-1 染色增加。Hhep定殖的小鼠顯示腫瘤周圍和腫瘤內部的TLSs數(shù)量增加，與TLS形成相關的基因表達增加，以上數(shù)據(jù)表明，Hhep 定殖促使小鼠結腸淋巴網(wǎng)絡的擴張。
4. Hhep定殖驅動Hhep特異性CD4⁺Tfh細胞擴增
抗體介導的耗竭實驗顯示，抗腫瘤免疫不依賴于CD8⁺T細胞，但依賴于CD4⁺T細胞。因此，作者分析了結腸中CD4⁺T細胞對Hhep定殖的反應，流式結果顯示，在Hhep定殖后，CD4⁺ T細胞中Tfh細胞（CXCR5⁺PD1⁺CD4⁺ T cells）的百分比持續(xù)增加，即在結直腸腫瘤的背景下，Hhep定殖驅動Hhep特異性Tfh細胞擴增。
5. Tfh細胞是Hhep菌介導的腫瘤控制和免疫浸潤所必需的
對TLSs進行FISH染色發(fā)現(xiàn)TLSs中含有Hhep菌和Hhep特異性T細胞。為了測試Hhep特異性Tfh細胞在TLS誘導和直接控制CRC中的重要性，作者利用AOM-DSS+Hhep處理Bcl6^fl/flCd4^Cre小鼠（Tfh 細胞缺陷型）誘導CRC證實了Tfh細胞是Hhep驅動的結腸TLS形成、腫瘤的免疫浸潤和控制腫瘤生長所必需的。所有數(shù)據(jù)表明，在CRC動物模型中，Hhep特異性Tfh細胞足以驅動TLS形成、增加免疫浸潤并導致腫瘤減少或清除。癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)庫中對CRC患者的分析表明，豐富的Tfh細胞特征通常存在于處于較低腫瘤階段的患者體內，并且還與更長的無進展生存期相關，因此，在小鼠和人類患者中，Tfh細胞和TLS的存在與更好地控制CRC相關。