由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19大流行在全球范圍內(nèi)已造成超過3.3億例感染。SARS-CoV-2刺突（Spike）蛋白在功能上不僅負(fù)責(zé)識別宿主細(xì)胞上的受體，同時還會介導(dǎo)細(xì)胞膜與病毒包膜融合，從而導(dǎo)致病毒感染宿主細(xì)胞。

目前全球流行的突變株在刺突蛋白上有多處突變發(fā)生，給疫苗的更新和設(shè)計都帶來了極大挑戰(zhàn)。SARS-CoV-2的 S蛋白單體包含兩個片段：氨基末端的S1亞基中包含一個受體結(jié)合域(RBD)，它能夠識別宿主ACE2受體并進(jìn)行相互作用；而羧基末端S2亞基催化病毒和細(xì)胞膜的融合，推動之后病毒RNA釋放進(jìn)入細(xì)胞，并在受感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的生物學(xué)過程，對病毒感染機(jī)制的研究是遏制當(dāng)前大流行和預(yù)防未來冠狀病毒爆發(fā)的一個研究重點(diǎn)。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宿主血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）蛋白能與病毒刺突蛋白結(jié)合，但結(jié)合后的分子機(jī)制還不明了。

北京時間2021年12月21號，發(fā)表在綜合性國際學(xué)術(shù)頂級期刊《PNAS》上的一項研究中，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所孟廣勛組和Dimitri Lavillette組揭示了病毒感染過程中S2’片段的產(chǎn)生以及該片段在病毒和受體之間的識別、膜融合等過程中發(fā)揮的作用。
 

技術(shù)路線
病毒的刺突蛋白能和ACE2相結(jié)合。在這項新研究中，研究人員通過細(xì)胞-細(xì)胞融合技術(shù)以及敲入人ACE2的小鼠中分離出來的各種細(xì)胞系和原代細(xì)胞來研究ACE2蛋白對于感染過程的重要性以及刺突上關(guān)鍵氨基酸對于蛋白水解的必要性。他們發(fā)現(xiàn)在ACE2能促進(jìn)病毒刺突水解產(chǎn)生S2’片段，這種關(guān)鍵性的水解作用對刺突介導(dǎo)的膜融合非常重要。
 

圖1. 本項研究中，作者通過體外細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)，分別在不同細(xì)胞中表達(dá)S蛋白、與有無ACE2受體的細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且檢測了S蛋白在融合過程中的酶切反應(yīng)、細(xì)胞膜融合與感染機(jī)制。

在ACE2蛋白存在的情況下，刺突驅(qū)動的合胞體形成會伴隨著S2’片段的形成

為了探究刺突 (S) 蛋白在活細(xì)胞中與其受體ACE2結(jié)合后的功能和生化特征，研究人員利用細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)從合胞體中獲得可能切割的刺突蛋白產(chǎn)物。

通過將HEK293T-ACE2細(xì)胞和表達(dá)刺突的HEK293T細(xì)胞共培養(yǎng)再對合胞體進(jìn)行裂解，以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究人員檢測到了約68 kDa S2’的條帶 ，而對照組細(xì)胞只表達(dá)刺突蛋白并不存在S2’條帶。除此之外，S2’條帶的亮度還取決于加入的 ACE2 表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量，表明ACE2的增加促進(jìn)了刺突蛋白的蛋白水解加工。
 

圖2. ACE2蛋白介導(dǎo)的刺突驅(qū)動的合胞體的形成會伴隨S2’片段的形成。

S2’位點(diǎn)的切割需要功能性的ACE2蛋白特異性的識別作用

之前的研究已經(jīng)證明，鼠源表達(dá)ACE2的細(xì)胞對于野生型SARS-CoV-2刺突介導(dǎo)的感染具有抵抗性，因此，研究人員探究了人和小鼠ACE2變體產(chǎn)生的S2’片段是否具有相同的作用。

為了驗(yàn)證這個假設(shè)，研究人員設(shè)計了Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同種屬ACE2蛋白的差異性。

研究人員發(fā)現(xiàn)，小鼠ACE2不能和刺突的RBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而人ACE2蛋白可以；不僅如此，人的ACE2蛋白能和全長的刺突互作，但是小鼠的蛋白無法互作。

研究人員為了在原代細(xì)胞中模擬刺突驅(qū)動的合胞體的形成，委托賽業(yè)生物構(gòu)建了人源ACE2基因敲入小鼠（H11位點(diǎn)），并且分離得到了敲入小鼠肺上皮細(xì)胞。該品系小鼠攜帶“K18 promoter-Kozak-human ACE2 CDS-P2A-CreERT2-rBGpA”cassette，既表達(dá)人源的ACE2受體，又有CreERt2，可用于研究特定宿主基因（floxed）在應(yīng)答新冠病毒感染中的作用。不僅如此，研究人員檢測到了S2’條帶，還觀察到了合胞體形成的綠色熒光信號。

圖3. 特異性的ACE2蛋白識別水解并產(chǎn)生S2’片段。

刺突815位精氨酸位點(diǎn)是S2’切割所必須的

已知SARS-CoV-2刺突蛋白可以在多個位置被切割，特別是S1/S2連接點(diǎn)(685)或S2’位點(diǎn) (815) 處的精氨酸。研究人員為了研究其功能，研究人員將這兩個位置的精氨酸突變?yōu)楸�氨酸�?br />
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HEK293T細(xì)胞表達(dá)的包含R815A突變的刺突導(dǎo)致蛋白無法水解出S2’，因此刺突上的815位點(diǎn)的精氨酸是S2’水解所必須的。

圖4. 刺突蛋白第815位的精氨酸是水解產(chǎn)生S2’所必須的

小結(jié)
以上實(shí)驗(yàn)證明了刺突蛋白參與病毒感染過程中，水解形成S2’蛋白的反應(yīng)是新冠病毒感染過程中不可或缺的分子事件之一，其中的815位點(diǎn)的精氨酸更是水解切割所必須的。