IF ：11.205  doi: 10.1073/pnas.2103087118.

摘要

主要結(jié)論

TrkA信號(hào)對(duì)于維持顱縫通暢至關(guān)重要：

1. TUBB3免疫組化染色顯示NGF-eGFP報(bào)告動(dòng)物矢狀縫的顱頂全覆蓋圖像。（比例尺，500μm）

2. TUBB3免疫組化染色顯示NGF-eGFP報(bào)告動(dòng)物冠狀縫和人字縫的的顱頂全覆蓋圖像。（比例尺，100μm）

3. P0矢狀縫冠狀面TUBB3染色。（比例尺，100μm）

4. OF或中部（Mid）縫間充質(zhì)內(nèi)TUBB3⁺ 神經(jīng)區(qū)域的量化。n=4到5只小鼠/基因型。

5. 在受孕時(shí)開始的1NMPP1治療后P0時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行顱頂?shù)恼�體骨骼染色（自上而下）。Oc，枕骨，Pa，頂骨。

6. 對(duì)照（Cont）和TrkA^F592A小鼠的額后縫和矢狀縫的平均縫線寬度。n=5到9只小鼠/基因型。

7. 從P6開始，1NMPP1治療后，P21顱頂（自上而下視圖）和矢狀縫（冠狀橫截面）的Micro-CT重建。下面的數(shù)字表示矢狀縫的平均寬度。

8. Cont和TrkA^F592A小鼠矢狀縫閉合百分率。

9. 側(cè)面頂骨之間相對(duì)于前后位置的二維平均縫寬。N=7只小鼠/基因型。圖中代表平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01。

TrkA⁺感覺神經(jīng)通過空間受限的分泌配體促進(jìn)顱縫的增殖擴(kuò)張：

1. 擴(kuò)散和對(duì)照（Cont）和TrkA^F592A突變動(dòng)物的P0矢狀縫的增殖和神經(jīng)支配，通過EdU標(biāo)記和TUBB3免疫組化染色可視化。（比例尺，200μm）

2. 在Cont和TrkA^F592A突變動(dòng)物中對(duì)OF或中部（中）縫間充質(zhì)中的EdU摻入進(jìn)行定量研究。（比例尺，50μm）n=4。

3. 使用微流控設(shè)備直接與DRG軸突共培養(yǎng)后原代MPCs的增殖，其中腔室通過微通道連接。（比例尺，10μm）TUBB3免疫組化染色觀察軸突。

4. 相對(duì)于最近的DRG軸突的EdU⁺  MPCs的空間分布。n=4。

5. 用DRG衍生的神經(jīng)條件培養(yǎng)基（CM）處理后MPCs中EdU標(biāo)記的定量。n=4（比例尺，25μm）

6. 在Cont和TrkA^F592A突變顱頂中發(fā)育頂骨的MAR。n=8。圖表代表平均值±SD、*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

體內(nèi)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)證實(shí)了TrkA^F592A小鼠矢狀縫中增殖標(biāo)志物的衰減：

1. Tubb3表達(dá)的空間特征圖和縫復(fù)合體定量分析。

2. 對(duì)照組（Cont）和TrkA^F592A小鼠矢狀縫spots內(nèi)的細(xì)胞周期基因Ccna2和預(yù)測細(xì)胞周期階段評(píng)分。

3. 用SpatialTime分析具有代表性的顱骨縫spots。

4. 使用已知的縫/祖細(xì)胞（頂部）和成骨（底部）標(biāo)志物驗(yàn)證SpatialTime分析。n=5到7只小鼠/基因型。

5. SpatialTime中細(xì)胞周期評(píng)分的變化。與中部（Mid）縫、OF和側(cè)面頂骨（Bone）對(duì)齊的相對(duì)SpatialTime區(qū)域在圖上表示。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)表明TrkA^F592A 顱頂中BMP/TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)中斷：

1. BMP信號(hào)模塊在對(duì)照（Cont）和TrkA^F592A顱頂之間評(píng)分的小提琴圖和空間表達(dá)數(shù)據(jù)，包括BMP激活子、BMP抑制子和整體BMP信號(hào)。

2. 在Cont和TrkA^F592A顱頂中SpatialTime的BMP激活子和抑制子基因表達(dá)的熱圖。

3. 基于Cont和TrkA^F592A顱頂從中部（Mid）縫到側(cè)面頂骨（Bone）的SpatialTime模塊評(píng)分確認(rèn)總體BMP激活。與中部縫、OF和側(cè)翼骨對(duì)齊的相對(duì)SpatialTime區(qū)域在圖上表示。n=5到7只小鼠/基因型。

4. 典型的BMP信號(hào)檢測，通過免疫熒光染色檢測矢狀縫和骨的冠狀橫截面的p-SMAD1/5/9來確認(rèn)。（比例尺，200μm）

5. Cont和TrkA^F592A顱頂TGF-β信號(hào)模塊的小提琴圖和空間表達(dá)評(píng)分，包括TGF-β激活子、TGF-β抑制子和TGF-β信號(hào)整體。

6. TGF-β激活因子和抑制因子基因在Cont和TrkA^F592A顱頂SpatialTime表達(dá)的熱圖。

7. 基于Cont和TrkA^F592A顱頂從中部（Mid）縫到側(cè)翼骨的SpatialTime模塊評(píng)分確認(rèn)總體 TGF-β激活。與中部縫、OF和側(cè)翼骨對(duì)齊的相對(duì)SpatialTime區(qū)域在圖上表示。n=5到7只小鼠/基因型。

8. 典型的BMP信號(hào)檢測，通過免疫熒光染色檢測矢狀縫和骨的冠狀橫截面的p-SMAD2來確認(rèn)。（比例尺，200μm）

FSTL1由TrkA⁺感覺神經(jīng)分泌，調(diào)節(jié)MPC的增殖和分化：

1. E18.5顱頂骨駐留細(xì)胞和腰椎DRG神經(jīng)元合并的scRNAseq數(shù)據(jù)集的UMAP投影。

2. 類群marker基因小提琴圖。

3. 相對(duì)于其他細(xì)胞群，DRG神經(jīng)元中候選分泌因子富集表達(dá)。

4. DRG細(xì)胞分成不同的神經(jīng)亞型。PEP，肽能型傷害感受器;TH，含酪氨酸羥化酶;NP, 非肽能型傷害感受器;和NF,神經(jīng)絲。

5. DRG亞群marker基因小提琴圖。

6. PEP和NP神經(jīng)亞型中TrkA（由Ntrk1編碼）表達(dá)的特征和小提琴圖。

7. 小提琴圖顯示候選基因在不同神經(jīng)亞型中的表達(dá)。

8. 在對(duì)照DRG細(xì)胞體或與MPCs直接軸突共培養(yǎng)后，在TrkA⁺神經(jīng)亞型中富集表達(dá)的候選基因。

9. rmFSTL1（250 ng/mL）處理48h后MPCs的增殖情況。

10. 有或沒有rmFSTL1的早期成骨誘導(dǎo)后基因表達(dá)。虛線表示成骨誘導(dǎo)第0天獲得的值。

11. 使用或不使用rmFSTL1（250 ng/mL）的成骨分化21d后的MPCs進(jìn)行茜素紅（AR）染色和定量。n=4。

12. 使用新鮮神經(jīng)培養(yǎng)基、非靶向培養(yǎng)基（NT CM）或Fstl1靶向培養(yǎng)基（KD CM）siRNA處理后MPCs的增殖，n=3。圖形代表平均值±SD，*P< 0.05，**P<0.01 ***P<0.001。a.u：任意單位，EC：內(nèi)皮細(xì)胞。

討論

骨縫是由擴(kuò)張的祖細(xì)胞增殖和沿骨板向內(nèi)閉合礦化的平衡維持的。TrkA⁺感覺神經(jīng)，通過NGF引導(dǎo)至顱縫，分泌FSTL1等因子，調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的激活和擴(kuò)張，抑制BMP介導(dǎo)的終末分化。TrkA抑制損傷感覺神經(jīng)，減少縫間充質(zhì)擴(kuò)張，導(dǎo)致縫過早閉合。