一種快速的分類外周血PBMC細胞亞群的方法
默克生命科學帶你走進 PBMC免疫細胞，免疫細胞在免疫調節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面，具有重要的應用潛力。 PBMC是基礎研究和臨床實驗室中廣泛使用的細胞。
早在2000年國際腫瘤生物治療及基因治療年會中便提出，免疫細胞療法是現(xiàn)代科技中最有希望徹底清除癌細胞的腫瘤治療方法。而免疫細胞在免疫調節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面，具有重要的應用潛力。
外周血單個核細胞（PBMC）
免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體防御機制中起著不可或缺的作用，也是免疫實驗中經常會用到的細胞，從血液中分離得到，常應用于臨床診斷、免疫治療和免疫監(jiān)測研究中。它是由具有單個圓形細胞核的血細胞組成，如單核細胞和淋巴細胞，淋巴細胞群由T細胞、B細胞和自然殺傷（NK）細胞組成。
分析。
如何分離PBMC？并進行定量分析？
PBMC是基礎研究和臨床實驗室中廣泛使用的細胞。這里介紹一種快速、簡單、可靠的方法從血液中分離PBMC，并用三種方法測定PBMC總濃度。
Ficoll®密度梯度離心法
PBMC分離的常用方法1–3，也叫做平衡密度梯度離心法：使用超速離心機對小分子物質溶液，長時間離心達到沉降平衡，在離心管內從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。
若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。不同大小的細胞會分散在不同的層（圖1）。
底層包含F(xiàn)icoll®聚集的紅細胞。緊靠這一層的是一個彌漫層，主要包含粒細胞和未結合的Ficoll®。由于密度稍低，淋巴細胞（包括單核PBMC部分）沉積在Ficoll®和最上層血漿/血小板層之間的界面上。將PBMC從界面上取出，使用PBS或細胞培養(yǎng)基洗滌，去除殘留的Ficoll。分離好的細胞就可以進入下一步的分析和培養(yǎng)過程。
Scepter™ 細胞計數器定量分析
Scepter™ 細胞計數器基于電阻法的庫爾特原理，采用手持式設計，操作簡單、結果更為準確�；趲鞝柼卦砜梢栽趤單⒚缀蛠喥た朔肿雍Y分辨率級別上區(qū)分細胞直徑和體積。
通過配備的40μm孔徑的傳感器Scepter™能夠精確的計數范圍更廣泛的細胞類型，包括直徑<6μm的小細胞，如PBMC和紅細胞（RBC）4，在PBMC的細胞分群中可以得到非常好的結果。
材料和方法，敲黑板
本方案采用50mL離心管中加入15mL Ficoll®可以較好的處理10 mL脫纖或抗凝劑*處理的外周血（或外周血灰黃層細胞），更小體積的離心管如15mL也可以使用，但更大體積的Ficoll®有助于更高效的去除紅細胞，提高PBMC產量。
* 建議使用采集后24h的新鮮分離的血液樣本以確保分離細胞保持較高的活性，
* 抗凝劑包括：肝素、EDTA、檸檬酸、檸檬酸葡萄糖（ACD）和檸檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
PBMC的Ficoll®密度梯度分離步驟
1. 將10毫升血液從采集瓶轉移到50毫升離心管中。
2. 添加等量的PBS（1X EmbryoMax®PBS，BSS-1006-A）并通過反復吹打混合樣品
注：稀釋血液可降低紅細胞聚集程度，并釋放RBC結合的PBMC。如果未稀釋，PBMC可能與紅細胞共沉淀，降低產量。
3. 向第二個50毫升試管中加入15毫升Ficoll®。
4. 通過緩慢移液并以最小的力小心地將稀釋后的血液分層到Ficoll®上。
注：將稀釋后的血液輕輕移液到分離介質上，使試管保持一定角度，以添加到Ficoll®中。為了獲得良好的分離，在離心前保持血液和Ficoll®層的分離至關重要
5. 在不使用制動器的情況下，在18–24°C溫度下以400 g x 30 min的速度離心。
注：較高溫度（37°C）會促進紅細胞聚集并降低產量，而較低溫度（4°C）會抑制聚集，降低純度。我們建議在18–24°C下進行離心。
6. 小心地從離心機上拆下管子，以免干擾分層。
7. 抽出上部的質膜層，小心不要干擾到下部的PBMC界面。
8. 將PBMC層轉移到新的50 mL試管中�；厥盏捏w積應約為10–12 mL。
注意：盡量收集整個PMBC層，同時避免相鄰的Ficoll（R）介質和質膜層。否則將分別導致粒細胞或血小板和血漿蛋白的污染。
9. 使用~3體積的PBS在18–24°C下以100 g x 10 min的速度離心清洗PBMC部分。
10. 倒出上清液。將細胞重懸在5毫升PBS中。將PBS加注至50 mL，然后重復清洗步驟。
11. 可選：重復清洗步驟一次
12. 清除上清液并將細胞顆粒重新懸浮在適當體積的PBS（或培養(yǎng)基）中。
注：每毫升血液健康血液中可以獲得0.5至3 x 106個PBMC細胞。對于10毫升血液，在5毫升PBS中重新懸浮顆粒進行初始計數。在此步驟后添加Rosetteep®人類總淋巴細胞濃縮雞尾酒（StemCell Technologies目錄號15223），可大大提高PBMC群的純化。
13.使用Scepter™ 細胞計數器和Guava easyCyte™ 流式細胞儀。
14.樣品可能需要進一步稀釋，以便使用Scepter™進行準確計數，40μm孔徑傳感器的工作濃度范圍=5 x 104–1.5 x 106。
三種方法測定PBMC總濃度
Scepter™ 細胞計數
Scepter™ 細胞計數器使用40μm的傳感器，需要吸入75μL細胞懸浮液吸入傳感器。Scepter™ 細胞計數器檢測通過傳感器孔徑的每個細胞，計算細胞濃度，并在屏幕上顯示基于細胞大小的直方圖，并計算出不同淋巴細胞和單核細胞群體的個數，并通過體積大小進行分群。
Guava™ 細胞計數
每10μL PBMC樣品在190μL PBS中稀釋。然后在Guava easyCyte ™流式細胞儀上 測定淋巴細胞和單核細胞組分的濃度。
細胞表面染色和亞群測定
對于每個樣品，將100000個PBMC重新懸浮在100μL PBS+0.1%BSA中。為了區(qū)分PBMC中存在的離散細胞亞群，使用以下熒光標記抗體組合對樣本進行染色：抗CD3-PE（T細胞）、抗CD19-Alexa-Fluor®488（B細胞）、抗CD16/CD56-APC（NK細胞）和抗CD14-PECy7（單核細胞）（eBioscience）。樣品在室溫下培養(yǎng)20分鐘，用PBS清洗，并在采集前在200μL PBS中再懸浮。在Guava easyCyte™ HT流式細胞儀上分析樣品（3000個細胞/樣品孔）。
結果
使用Ficoll®進行密度梯度離心，可將全血特征性地分離為4層：最上層的血漿層含有血小板、一層很薄的PBMC帶、彌漫性Ficoll®層含有粒細胞和聚集的紅細胞顆粒。PBMC可進一步細分為兩個主要群體：淋巴細胞和單核細胞。
用熒光抗體標記物對每個樣本的小份樣本進行染色，以確定PBMC的特征表型。淋巴細胞亞群可進一步細分為T細胞（CD3+）、B細胞（CD19+）和NK細胞（CD16/56+）。根據CD14的差異表達，單核細胞可以與總淋巴細胞區(qū)分開來。使用流式細胞儀和權杖對樣品進行稀釋和分析™ 用于測定PBMC總濃度的細胞計數器。
Figure 2.
Representative data comparing PBMC samples acquired on the flow cytometer and Scepter™ cell counter. Dot plots show debris
從圖2中的散點圖中，每個樣本中發(fā)現(xiàn)了幾個主要群體：
Table 1. Lymphocyte and monocyte subset frequencies from nine individual PBMC samples. Aliquots from each sample were analyzed using the Guava easyCyte™ and Scepter™ instruments.
a Values were derived from the diameter histogram plot.
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events measured on guava easyCyte™ platform.
c Staining frequencies derived as follows:
%Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells)
%Monocytes = %CD14+ cells
在9個樣本中，淋巴細胞和單核細胞的平均細胞直徑分別為7.23±0.30μm和10.02±0.20μm。所得值與先前報道的大小范圍一致。5此外，PBMC總濃度通過三種方法測定：
Figure 3. Correlation of PBMC concentrations measured using three different methods of analysis: flow cytometric cell counting, Scepter™ cell counting, and flow cytometry analysis of fluorescently labeled cells.
a Values were derived from the diameter histogram plot
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events
c Population counts derived as follows: %Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells); %Monocytes = %CD14+ cells
總結：PBMC是基礎研究和臨床實驗室中廣泛使用的細胞。
通過離心法從血液中分離PBMC最關鍵第一步。在下游分析中Scepter™可以準確的對不同類群的細胞進行有效的分群和計數，其結果和流式直測以及抗體染色的結果有很好的一致性。
參考文獻
General
密度梯度離心還可以用在分離葉綠體、病毒純化、質膜、細胞器等。
如需詳細操作內容，點擊link（https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/primary-cell-culture/ficoll-400）
早在2000年國際腫瘤生物治療及基因治療年會中便提出，免疫細胞療法是現(xiàn)代科技中最有希望徹底清除癌細胞的腫瘤治療方法。而免疫細胞在免疫調節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面，具有重要的應用潛力。
外周血單個核細胞（PBMC）
免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體防御機制中起著不可或缺的作用，也是免疫實驗中經常會用到的細胞，從血液中分離得到，常應用于臨床診斷、免疫治療和免疫監(jiān)測研究中。它是由具有單個圓形細胞核的血細胞組成，如單核細胞和淋巴細胞，淋巴細胞群由T細胞、B細胞和自然殺傷（NK）細胞組成。
分析。
如何分離PBMC？并進行定量分析？
PBMC是基礎研究和臨床實驗室中廣泛使用的細胞。這里介紹一種快速、簡單、可靠的方法從血液中分離PBMC，并用三種方法測定PBMC總濃度。
Ficoll®密度梯度離心法
PBMC分離的常用方法1–3，也叫做平衡密度梯度離心法：使用超速離心機對小分子物質溶液，長時間離心達到沉降平衡，在離心管內從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。
若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。不同大小的細胞會分散在不同的層（圖1）。
底層包含F(xiàn)icoll®聚集的紅細胞。緊靠這一層的是一個彌漫層，主要包含粒細胞和未結合的Ficoll®。由于密度稍低，淋巴細胞（包括單核PBMC部分）沉積在Ficoll®和最上層血漿/血小板層之間的界面上。將PBMC從界面上取出，使用PBS或細胞培養(yǎng)基洗滌，去除殘留的Ficoll。分離好的細胞就可以進入下一步的分析和培養(yǎng)過程。
Scepter™ 細胞計數器定量分析
Scepter™ 細胞計數器基于電阻法的庫爾特原理，采用手持式設計，操作簡單、結果更為準確�；趲鞝柼卦砜梢栽趤單⒚缀蛠喥た朔肿雍Y分辨率級別上區(qū)分細胞直徑和體積。
通過配備的40μm孔徑的傳感器Scepter™能夠精確的計數范圍更廣泛的細胞類型，包括直徑<6μm的小細胞，如PBMC和紅細胞（RBC）4，在PBMC的細胞分群中可以得到非常好的結果。
材料和方法，敲黑板
本方案采用50mL離心管中加入15mL Ficoll®可以較好的處理10 mL脫纖或抗凝劑*處理的外周血（或外周血灰黃層細胞），更小體積的離心管如15mL也可以使用，但更大體積的Ficoll®有助于更高效的去除紅細胞，提高PBMC產量。
* 建議使用采集后24h的新鮮分離的血液樣本以確保分離細胞保持較高的活性，
* 抗凝劑包括：肝素、EDTA、檸檬酸、檸檬酸葡萄糖（ACD）和檸檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
PBMC的Ficoll®密度梯度分離步驟
1. 將10毫升血液從采集瓶轉移到50毫升離心管中。
2. 添加等量的PBS（1X EmbryoMax®PBS，BSS-1006-A）并通過反復吹打混合樣品
注：稀釋血液可降低紅細胞聚集程度，并釋放RBC結合的PBMC。如果未稀釋，PBMC可能與紅細胞共沉淀，降低產量。
3. 向第二個50毫升試管中加入15毫升Ficoll®。
4. 通過緩慢移液并以最小的力小心地將稀釋后的血液分層到Ficoll®上。
注：將稀釋后的血液輕輕移液到分離介質上，使試管保持一定角度，以添加到Ficoll®中。為了獲得良好的分離，在離心前保持血液和Ficoll®層的分離至關重要
5. 在不使用制動器的情況下，在18–24°C溫度下以400 g x 30 min的速度離心。
注：較高溫度（37°C）會促進紅細胞聚集并降低產量，而較低溫度（4°C）會抑制聚集，降低純度。我們建議在18–24°C下進行離心。
6. 小心地從離心機上拆下管子，以免干擾分層。
7. 抽出上部的質膜層，小心不要干擾到下部的PBMC界面。
8. 將PBMC層轉移到新的50 mL試管中�；厥盏捏w積應約為10–12 mL。
注意：盡量收集整個PMBC層，同時避免相鄰的Ficoll（R）介質和質膜層。否則將分別導致粒細胞或血小板和血漿蛋白的污染。
9. 使用~3體積的PBS在18–24°C下以100 g x 10 min的速度離心清洗PBMC部分。
10. 倒出上清液。將細胞重懸在5毫升PBS中。將PBS加注至50 mL，然后重復清洗步驟。
11. 可選：重復清洗步驟一次
12. 清除上清液并將細胞顆粒重新懸浮在適當體積的PBS（或培養(yǎng)基）中。
注：每毫升血液健康血液中可以獲得0.5至3 x 106個PBMC細胞。對于10毫升血液，在5毫升PBS中重新懸浮顆粒進行初始計數。在此步驟后添加Rosetteep®人類總淋巴細胞濃縮雞尾酒（StemCell Technologies目錄號15223），可大大提高PBMC群的純化。
13.使用Scepter™ 細胞計數器和Guava easyCyte™ 流式細胞儀。
14.樣品可能需要進一步稀釋，以便使用Scepter™進行準確計數，40μm孔徑傳感器的工作濃度范圍=5 x 104–1.5 x 106。
三種方法測定PBMC總濃度
Scepter™ 細胞計數
Scepter™ 細胞計數器使用40μm的傳感器，需要吸入75μL細胞懸浮液吸入傳感器。Scepter™ 細胞計數器檢測通過傳感器孔徑的每個細胞，計算細胞濃度，并在屏幕上顯示基于細胞大小的直方圖，并計算出不同淋巴細胞和單核細胞群體的個數，并通過體積大小進行分群。
Guava™ 細胞計數
每10μL PBMC樣品在190μL PBS中稀釋。然后在Guava easyCyte ™流式細胞儀上 測定淋巴細胞和單核細胞組分的濃度。
細胞表面染色和亞群測定
對于每個樣品，將100000個PBMC重新懸浮在100μL PBS+0.1%BSA中。為了區(qū)分PBMC中存在的離散細胞亞群，使用以下熒光標記抗體組合對樣本進行染色：抗CD3-PE（T細胞）、抗CD19-Alexa-Fluor®488（B細胞）、抗CD16/CD56-APC（NK細胞）和抗CD14-PECy7（單核細胞）（eBioscience）。樣品在室溫下培養(yǎng)20分鐘，用PBS清洗，并在采集前在200μL PBS中再懸浮。在Guava easyCyte™ HT流式細胞儀上分析樣品（3000個細胞/樣品孔）。
結果
使用Ficoll®進行密度梯度離心，可將全血特征性地分離為4層：最上層的血漿層含有血小板、一層很薄的PBMC帶、彌漫性Ficoll®層含有粒細胞和聚集的紅細胞顆粒。PBMC可進一步細分為兩個主要群體：淋巴細胞和單核細胞。
用熒光抗體標記物對每個樣本的小份樣本進行染色，以確定PBMC的特征表型。淋巴細胞亞群可進一步細分為T細胞（CD3+）、B細胞（CD19+）和NK細胞（CD16/56+）。根據CD14的差異表達，單核細胞可以與總淋巴細胞區(qū)分開來。使用流式細胞儀和權杖對樣品進行稀釋和分析™ 用于測定PBMC總濃度的細胞計數器。
Figure 2.
Representative data comparing PBMC samples acquired on the flow cytometer and Scepter™ cell counter. Dot plots show debris
從圖2中的散點圖中，每個樣本中發(fā)現(xiàn)了幾個主要群體：
- 碎片和紅細胞（黑色）
- 淋巴細胞亞群（由T細胞（紅色）
- B細胞（Aqua）
- NK細胞（綠色）
- 單核細胞亞群（藍色）
Table 1. Lymphocyte and monocyte subset frequencies from nine individual PBMC samples. Aliquots from each sample were analyzed using the Guava easyCyte™ and Scepter™ instruments.
a Values were derived from the diameter histogram plot.
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events measured on guava easyCyte™ platform.
c Staining frequencies derived as follows:
%Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells)
%Monocytes = %CD14+ cells
在9個樣本中，淋巴細胞和單核細胞的平均細胞直徑分別為7.23±0.30μm和10.02±0.20μm。所得值與先前報道的大小范圍一致。5此外，PBMC總濃度通過三種方法測定：
- Scepter™ 直徑圖
- 流式細胞儀前向散射
- 抗體染色（圖3）
Figure 3. Correlation of PBMC concentrations measured using three different methods of analysis: flow cytometric cell counting, Scepter™ cell counting, and flow cytometry analysis of fluorescently labeled cells.
a Values were derived from the diameter histogram plot
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events
c Population counts derived as follows: %Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells); %Monocytes = %CD14+ cells
總結：PBMC是基礎研究和臨床實驗室中廣泛使用的細胞。
通過離心法從血液中分離PBMC最關鍵第一步。在下游分析中Scepter™可以準確的對不同類群的細胞進行有效的分群和計數，其結果和流式直測以及抗體染色的結果有很好的一致性。
參考文獻
- Boyum, A. (1968) Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:77-89.
- Harris, R. and Ukaijiofo, E. (1970) Tissue typing using a routine one-step lymphocyte separation technique. British J. Haemotol. 18:229- 35.
- Bain, B. and Pshyk, K. (1972) Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplantation Proceedings. 4:161-63.
- Smith, J., and Ongena, K. The New Scepter™ 2.0 Cell Counter. Cellutions 2011 Vol. 1: p 19-22).
- Daniels, V.G., Wheater, P.R., & Burkitt, H.G. (1979). Functional histology: A text and colour atlas. Edinburgh: Churchill Livingstone. ISBN 0-443- 01657-7.
General
- Prager, E., et al. (2001) Induction of Hyporesponsiveness and Impaired T Lymphocyte Activation by the CD31 Receptor: Ligand Pathway in T-Cells. J. Immunol. 166: 2364-2371.
- Smith, J., et al. The New Scepter™ 2.0 Cell Counter Enables the Analysis of a Wider Range of Cell Sizes and Types With High Precision. EMD Millipore Cellutions 2011 Vol. 1: p 19-22.
密度梯度離心還可以用在分離葉綠體、病毒純化、質膜、細胞器等。
如需詳細操作內容，點擊link（https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/primary-cell-culture/ficoll-400）
