藥界新寵——LYTAC 與靶向蛋白降解技術
靶向蛋白降解 (TPD) 是一種有效性的，高度選擇性的誘發(fā)蛋白降解方式。近年來，以 PROTAC 為代表的 TPD 技術的研究如火如荼。PROTAC 主要降解的是胞內(nèi)蛋白，實際上，有 40% 的基因產(chǎn)物為胞外和膜相關蛋白，如生長因子、細胞因子和趨化因子，它們在多種疾病 (如癌癥和炎癥) 中引發(fā)異常信號傳導。那么，有沒有一種誘導胞外蛋白降解的技術來彌補 PROTAC 的這一局限呢？
PROTAC 是通過「清潔工」——泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS) 來降解目標蛋白 (POI)，而此途徑是胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑，因此 PROTAC 主要降解胞內(nèi)蛋白。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑：是目前最主要的兩條降解途徑。這兩條降解途徑之間相互聯(lián)系，具有協(xié)同和補償作用。
溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)
近日，來自斯坦福大學 Bertozzi 教授的研究團隊在 Nature 上報道了一項靶向胞外蛋白的降解技術——溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)。并且證明 LYTAC 成功降解了表皮生長因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體 1 (PD-L1) 和載脂蛋白 E4。斯坦福大學的研究人員還表明，在細胞中，LYTAC 可以靶向并降解阿爾茨海默癥和癌癥中的重要蛋白。繼 PROTAC 之后，LYTAC 可能會成為另一個“爆款”。
圖 1. LYTAC 作用機制[3]
LYTAC 含有兩個結合域，一個寡糖肽基團 (Oligoglycopeptide group) 和一個能與目標蛋白質(zhì)結合的抗體或小分子，兩者用 Linker 連接。寡糖肽基團在細胞表面與跨膜受體 CI-M6PR 結合，所得復合物被細胞膜吞沒，形成運輸囊泡，并在 CI-M6PR 作用下將復合物轉移至溶酶體降解，而受體 CI-M6PR 可循環(huán)利用并回到細胞膜 (如圖 1)。例如通過使用抗 EGFR 單克隆抗體 Cetuximab 與 CI-M6PR 配體 M6Pn 糖多肽綴合構建 LYTAC Ab-2 來降解 EGFR。
另外，在去年六月份，PROTAC 先驅(qū)、耶魯大學的 Crews 小組在 ACS Central Science 雜志上發(fā)表了另一項胞外蛋白降解技術——內(nèi)源性嵌合體 (ENDTAC)。但該文章由于無法重現(xiàn)數(shù)據(jù)，已經(jīng)于今年年初撤回。
不論是 LYTAC 還是 ENDTAC，都需要研究者繼續(xù)探索，推動靶向胞外蛋白蛋白技術的進一步發(fā)展。
當然，“蛋白降解家族”可不止 PROTAC，LYTAC 兩個成員，還有很多其他的新興靶向蛋白技術，如光控靶蛋白降解 (photo-PROTAC)、分子膠 (Molecular Glue)，自噬介導的靶蛋白降解 (AUTAC)、利用 TRIM21 E3 連接酶靶向降解蛋白的 Trim-Away，基因編碼降解劑 (BioPROTAC) 等，這些技術不僅擴展了蛋白降解的途徑，同時提升了蛋白降解的精確度。
■ PROTAC 與 PhotoPROTAC：
在之前的文章中給大家介紹過 PROTAC 下面來畫一下重點吧。
PROTAC 一直是靶向蛋白降解家族的代表。
1、由三部分組成的雙功能雜交化合物：靶蛋白配體+Linker+E3 泛素連接酶配體 (圖 2)。
2、通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)靶向降解蛋白：PROTAC 可以與 E3 泛素連接酶和靶蛋白結合，誘導形成三元復合物，導致多聚泛素化并隨后降解靶蛋白。PROTAC 可以回收繼續(xù)利用 (圖 2)。
3、不僅具有靶向“不可成藥”蛋白的潛力，并且能夠在低濃度下有效誘導蛋白質(zhì)降解。PROTAC 還能靶向突變蛋白，克服小分子抑制劑耐藥性的問題。
圖 2. PROTACs 的作用機制[6]
就在今年 7 月，PROTAC 先驅(qū) Crews 小組又在 ACS Central Science 發(fā)表了首個具有細胞活性的靶向降解 KRAS G12C 突變的 PROTAC 分子 LC-2。LC-2 由 MRTX849 與 VHL E3 連接酶配體連接組成，并在多種癌細胞系中誘導快速且持續(xù)的 KRAS G12C 降解。
與大多數(shù)小分子抑制劑主要阻斷目標酶的催化活性不同，PROTACs 旨在降解目標蛋白。這種特性提供了優(yōu)勢的同時也有潛在的弊端，當全身給藥時，它可能會導致正常細胞中的目標蛋白不受控制的降解，產(chǎn)生非特異性毒性。而光控開關 PROTACs 正是在 PROTAC 上添加一個可控的開關，使它在黑暗中無活性，特定波長的可見光下會被激活，降解目標蛋白。因此，光控開關 PROTACs 能夠在癌細胞或組織中激活，在時間和空間上精準地控制靶向蛋白降解，消除潛在的非特異性毒性。
圖 3. opto-pomalidomide 以 UVA 依賴的方式降解目標蛋白模式圖[10]
今年年初 Science Advances 上的兩篇背靠背文章，分別發(fā)表了關于光控的精準時空激活的 PROTAC。其中哈佛醫(yī)學院和西奈山醫(yī)學院研究團隊設計了 opto-PROTACs。他們通過在泊馬度胺 (Pomalidomide) 上添加一個對光不穩(wěn)定的 Caging 基團，暫時阻止 Pomalidomide 與 E3 連接酶 CRBN 的相互作用，之后利用紫外線 A (UVA) 照射，opto-pomalidomide 分子以時間依賴性方式進行光解，從籠狀 (Caged) 狀態(tài)中解開，并成功介導 IKZF1/3 降解。他們據(jù)此原理設計的光控 opto-dBET1 以及 opto-dALK 也都分別成功介導了 BRD 蛋白和 ALK 融合蛋白的降解 (圖 3)。
圖 4. PHOTAC 的示意圖分子經(jīng)照射后在非活性形式 (藍色五邊形) 和
活性形式 (黃色星形) 之間切換[11]
同樣的，紐約大學的研究團隊開發(fā)的靶向 BET 蛋白 (BRD2/3/4) 或 FKBP12 的光開關 PHOTAC 分子，也證明了光控的精準時空激活的有效性 (圖 4)。
■ 分子膠 (Molecular Glue)：
分子膠是一類誘導或穩(wěn)定蛋白之間相互作用的小分子化合物，通過結合 E3 泛素連接酶并修飾其分子表面，誘導新的蛋白質(zhì)間相互作用 (正常情況下兩者原先沒有相互作用)，并在連接酶的作用下，導致蛋白降解 。沙利度胺 (Thalidomide) 及類似物泊馬度胺 (Pomalidomide) 和來那度胺 (Lenalidomide) 是一類免疫調(diào)節(jié)類藥物 (IMiDs)，也是典型的分子膠，它們可對 CRBN 進行修飾，形成新的蛋白間相互作用, 降解幾種鋅指轉錄因子，如形成 CRBN-IMiDs-IKZF1，隨后降解 IKZF1 (圖 5)。
圖 5. IMiDs 與 CRL4 E3 連接酶底物受體 CRBN 結合，
為泛素化和蛋白酶體降解募集底物[12]
到目前為止，除 CRBN/IMiD 分子膠之外，分子膠的設計構想仍依賴偶然的發(fā)現(xiàn)，包括通過系統(tǒng)地挖掘數(shù)據(jù)庫得到的 CDK 抑制劑 CR8 分子，以及優(yōu)化 MDM2 雙功能降解劑 MD-222 得到的 MG-277 。
■ 自噬介導的靶向蛋白質(zhì)降解 (AUTAC)：
自噬靶向嵌合體 (AUTAC)，顧名思義，是一種利用自噬機制的降解劑，能夠降解目標蛋白以及受損的細胞器，例如受損的線粒體。AUTAC 由一個模仿 S-guanylation (即，鳥嘌呤衍生物) 的降解標簽和目標蛋白配體通過 Linker 組成。S-guanylation 是一種翻譯后修飾，可通過誘導 K63 多泛素化來標記選擇性自噬的目標蛋白。因此，目標蛋白被自噬受體 SQSTM1/p62 識別，并被募集到選擇性自噬途徑進行降解 (圖 6)。
圖 6. AUTAC 作用機制[15]
■ TRIM-Away 技術：
Trim-Away，一種在細胞內(nèi)快速降解目標蛋白的新技術。它利用內(nèi)源性泛素連接酶 TRIM21 識別抗體的 Fc 區(qū)來降解蛋白抗體復合物。TRIM21 是一種 E3 泛素連接酶，可與抗體的 Fc 結構域高親和力結合。
在典型的 Trim-Away 中，蛋白質(zhì)降解可通過三個步驟完成：第一，引入靶向目標蛋白質(zhì)的抗體；第二，將內(nèi)源或外源/過表達的 TRIM21 募集至抗體結合的目標蛋白處；第三，蛋白酶體介導目標蛋白，抗體和 TRIM21 復合物的降解 (圖 7)。
相比于 DNA 敲除和 RNA 干擾等方式破壞靶蛋白，Trim-Away 不需預先修飾基因組或 mRNA 即可急性降解內(nèi)源蛋白，而且 Trim-Away 在幾分鐘內(nèi)就能去除靶蛋白，這種快速性可以最大程度地減少補償機制以及繼發(fā)性等。
圖 7. TRIM-Away 機制圖[5]
除上述提及到的靶向蛋白降解技術外，另外還有 BioPROTAC 靶向蛋白降解技術，它基于基因編碼直接將肽或抗體模擬物與 E3 連接酶融合，通過肽或蛋白識別域結合并降解目標蛋白。由于 BioPROTAC 依賴于基因編碼，因此存在一定的局限性。
結語
靶向蛋白降解技術的前途十分光明。盡管靶向蛋白降解技術存在一些懸而未決的問題和挑戰(zhàn)，例如，如何改善 PROTAC 分子的整體藥代動力學特性，S-guanylation 介導的 K63 泛素化的具體分子機制是怎樣的，能否利用 AUTAC 來降解 COVID-19 的關鍵蛋白等。但毫無疑問，靶向蛋白降解技術填補了靶向“不可藥物”蛋白的空白，并提供了基于藥物化學的新的治療途徑。同時，靶向蛋白降解技術一般是將小分子藥物設計成為一種新型的藥物，這無疑也為小分子藥物的用途提供了廣闊的思路。
相關產(chǎn)品
PROTACs
MCE 收錄了 100+ 種 PROTAC 降解劑以及各類 PROTAC 組分。PROTAC 降解劑：包括靶向 BET、STAT、MDM2、CDK、ER 、AR 等；PROTAC 組分包括 PEGs, Alkyl-Chain 和 Alkyl/ether 在內(nèi)的 2000+Linker, 多種 E3 連接酶配體以及 E3 連接酶配體-Linker 偶聯(lián)物，多種靶蛋白配體以及靶蛋白配體-Linker 偶聯(lián)物。
CR8/(R)-CR8
有效的 CDK 抑制劑。作為分子膠來降解細胞周期素 K。
MG-277
分子膠降解劑，有效地誘導翻譯終止因子 GSPT1 的降解，DC 50 為 1.3 nM。
Lenalidomide
Thalidomide 的衍生物，一種泛素 E3 連接酶 cereblon 的配體，可通過 CRBN-CRL4 泛素連接酶對兩種淋巴轉錄因子 IKZF1 和 IKZF3 進行選擇性泛素化和降解。
Pomalidomide
第三代免疫調(diào)節(jié)劑，與 E3 連接酶 cereblon 相互作用，可誘導 IKZF1 和 IKZF3 蛋白的降解。
Thalidomide
抑制 cereblon，Kd 約為 250 nM，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤作用。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務
縮寫：
TPD：Targeted protein degradation
CI-M6PR：Cation-independent mannose-6-phosphate receptor
POI：Protein of interest
參考文獻：
2. Steven M Banik, et al. Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins. Nature. 2020 Aug;584(7820):291-297.
3. REBECCA MCCLELLAN. Stanford chemists craft molecular scalpels to clear unwanted proteins from cell surfaces. news.stanford.edu.
4. Nalawansha DA, et al. Retraction of "Targeted Protein Internalization and Degradation by ENDosome TArgeting Chimeras (ENDTACs)". ACS Cent Sci. 2020;6(2):312.
5. Luh LM, et al. Prey for the Proteasome: Targeted Protein Degradation-A Medicinal Chemist´s Perspective. Angewandte Chemie International Edition. 2020.
6. Xiuyun Sun, et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry. Signal Transduct Target Ther. 2019; 4: 64.
7. Wang Y, et al. Degradation of proteins by PROTACs and other strategies. Acta Pharm Sin B. 2020;10(2):207-238.
8. Burslem GM, et al. The Advantages of Targeted Protein Degradation Over Inhibition: An RTK Case Study. Cell Chem Biol. 2018;25(1):67-77.e3.
9. Bond M J , et al. Targeted Degradation of Oncogenic KRAS G12C by VHL-Recruiting PROTACs[J]. 2020.
10. Liu J, et al. Light-induced control of protein destruction by opto-PROTAC. Sci Adv. 2020;6(8):eaay5154.
11. Reynders M, et al. PHOTACs enable optical control of protein degradation. Sci Adv. 2020;6(8):eaay5064.
12. Gao S, et al. Novel immunomodulatory drugs and neo-substrates. Biomark Res. 2020;8:2.
13. Słabicki M, et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. 2020 Jun 3.
14. Yang J, et al. Simple Structural Modifications Converting a Bona fide MDM2 PROTAC Degrader into a Molecular Glue Molecule: A Cautionary Tale in the Design of PROTAC Degraders. J Med Chem. 2019;62(21):9471-9487.
15. Takahashi D, et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Mol Cell. 2019;76(5):797-810.e10.
16. Clift D, et al. Acute and rapid degradation of endogenous proteins by Trim-Away.Nat Protoc. 2018 Oct;13(10):2149-2175.
17. Ding Y, et al. Emerging New Concepts of Degrader Technologies. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(7):464-474.
