研究人員在進行細胞實驗時，哪些原因會導(dǎo)致科研數(shù)據(jù)的波動與差錯？

1. 細胞微生物污染（如：支原體，細菌，真菌，病毒等）
2. 細胞交叉污染
3. 細胞基因突變
4. 細胞衰老
5. 人為操作失誤
 

平時，研究人員細胞的來源有三種，一種是直接從商業(yè)化公司（如ATCC、DSMZ、中科院細胞所）購買，另一種為自己從原代組織分離，還有一種是從其他實驗室或科研人員處獲取。

既然如此方便，我們?yōu)槭裁匆�自己建立細胞庫呢？有何意義？
細胞庫可以有效保持貯存細胞的生物學(xué)效用和功能，為科研實驗提供檢定合格、質(zhì)量穩(wěn)定、可持續(xù)獲得的細胞。

1. 節(jié)省實驗室空間、時間、經(jīng)費
2. 若實驗失敗，還有重來的機會
3. 確保實驗重復(fù)的一致性
4. 確保未來實驗的連貫性
因此實驗室有必要建立一個安全、規(guī)范、穩(wěn)定、可追溯的細胞庫，我們需要從源頭保證整個研究實驗的規(guī)范性。

目前，世界上較權(quán)威的細胞庫機構(gòu)或者研究院都采用三級細胞庫管理模式，即：原始細胞庫（PCB，Primary Cell Bank），主細胞庫（MCB，Master Cell Bank），工作細胞庫（WCB，Working Cell Bank）。

1. 原始細胞庫（PCB，Primary Cell Bank）

原始細胞庫（PCB，Primary Cell Bank），又名細胞種子（Cell Seed）或初級細胞庫（Pre-master Cell Bank），由一個原始細胞群體發(fā)展成為傳代穩(wěn)定的細胞群體，或者經(jīng)過克隆培養(yǎng)形成的均一細胞群體，經(jīng)檢定證明合格。將一定數(shù)量、成分均一的細胞懸液定量裝于細胞凍存管，與液氮或-130℃以下凍存，即為原始細胞庫，供建立主細胞庫使用。

2. 主細胞庫（MCB，Master Cell Bank）

主細胞庫（MCB，Master Cell Bank）指的是，原始細胞庫細胞傳代增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保存于液氮或-130℃以下。這些細胞經(jīng)檢定合格后，即為主細胞庫，供建立工作細胞庫使用。

3. 工作細胞庫（WCB，Working Cell Bank）

工作細胞庫（WCB，Working Cell Bank）是經(jīng)過主細胞庫傳代增殖，達到一定代次水平的細胞，混合后制成一批均質(zhì)細胞懸液，定量分裝于一定數(shù)量的細胞凍存管，保存于液氮或-130℃以下備用。這些細胞經(jīng)檢定證明合格后，即為工作細胞庫。

不同的細胞系傳代能力不同，因此，研究人員須根據(jù)自己的細胞系確定工作細胞的傳代次數(shù)。

▲ 細胞庫建立流程圖
 

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細胞庫的檢定

上面我們介紹過在進行各級細胞庫的建立時，都要進行檢定，合格后才可成為相應(yīng)細胞庫。細胞檢定主要包括以下幾個方面：細胞鑒別，細菌、真菌檢查，支原體檢查，細胞內(nèi)外源病毒因子檢查，致瘤性檢查，必要時還須進行細胞染色體、細胞生長特性、細胞均一度及穩(wěn)定性檢查。

▽ 細胞檢定項目

在建立這些細胞庫的過程，凍存這個操作步驟是非常重要的，必須要遵守“慢凍”原理，具體操作步驟可以點擊此處查看“細胞凍存的那些事兒”。
 

當建立好各級細胞庫后，重要的是要如何進行管理？
細胞庫的管理

研究人員應(yīng)檢測并維護細胞庫凍存器，以保證細胞庫貯存在一個高度穩(wěn)定的環(huán)境中。每種細胞庫均應(yīng)分別建立臺賬，詳細記錄放置位置 ，容器編號，分裝及凍存數(shù)量，取用記錄等。細胞庫中的每支細胞凍存管均應(yīng)具有細胞系/株名、代次、編號、凍存日期、貯存容器編號等信息。

▽  細胞系記錄表

 

為保證細胞凍存后仍具有良好的活力，每建立一級細胞庫，凍存前的細胞活力應(yīng)不低于90%，凍存后應(yīng)取一定量的（可代表凍存全過程）凍存管，復(fù)蘇細胞進行檢測，復(fù)蘇后細胞的活力應(yīng)不低于80%。一般細胞凍存2-3天溫度趨于穩(wěn)定后，即可進行細胞活力檢測。

▽ 細胞復(fù)蘇記錄表

 

那么我們在建立細胞庫的時候，應(yīng)該如何確定凍存數(shù)量和凍存密度呢？

原始細胞庫、主細胞庫和工作細胞庫凍存多少數(shù)量，可根據(jù)自己的需要確定，只要滿足后續(xù)科研實驗需求即可，即遵循“夠用原則”。一般經(jīng)驗來說，凍存的細胞密度為1-10×10⁶ cells/ml，凍存體積1-1.5 ml/管。
 

一些細胞冷凍保存細胞密度   ：

1. Normal human fibroblast（人成纖維細胞）：1-3×10⁶ cells/ml。
2. Hybridoma（雜交瘤細胞）：1-3×10⁶ cells/ml。
3. Adherent tumor lines（貼壁腫瘤細胞系）：5-7×10⁶ cells/ml，依細胞種類而異。Adenocarcinoma（腺癌細胞）解凍后須較高之密度，而HeLa只需要1-3×10⁶ cells/ml。
4. Other suspensions（懸浮細胞）：5-10×10⁶ cells/ml。
5. Human lymphocyte（人淋巴細胞）：至少5×10⁶ cells/ml。
 

 參考資料

1. 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：中國醫(yī)藥科技出版社，2015

細胞庫的建立方法介紹就到這里啦
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