體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)方法及導(dǎo)則
體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在化合物遺傳毒性評價(jià)中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗(yàn)列為第2個(gè)組織/終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn);體內(nèi)哺乳動物堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則(TG489)也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、不完整切除修復(fù)引起的DNA鏈的斷裂等任何感興趣,能夠制成合適細(xì)胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗(yàn)相比其檢測的是單細(xì)胞水平的DNA損傷,因此該試驗(yàn)敏感性較高,操作簡單,經(jīng)濟(jì)省時(shí)。
實(shí)驗(yàn)原理
彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay)也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(single cell gel electrophoresis.SCGE),是一種有效評估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理(如輻射、重金屬等)后,細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂,經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后,DNA解旋,在電場作用下,DNA 斷片遷移出細(xì)胞核,形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短,DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍,形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同,可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)(pH=8.4)和堿性彗星實(shí)驗(yàn)(pH>13)。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷,堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性,可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。
需要注意的是,試驗(yàn)過程中的個(gè)方面,包括樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度以及使用顯微鏡濾鏡和相機(jī)動態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究,可能影響DNA遷移。
堿性彗星試驗(yàn)指導(dǎo)原則
TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay,2016,OECD Guideline for the Testing of Chemicals
試驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)證明能夠?yàn)樗褂玫哪繕?biāo)組織獲得足夠質(zhì)量的單細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液,從而在彗星試驗(yàn)中建立實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Γ本﹨R智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司可提供專業(yè)毒理學(xué)服務(wù)。首先通過%尾DNA的評價(jià),對照處理組動物%尾DNA在低范圍內(nèi)。目前的數(shù)據(jù)表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數(shù))在大鼠肝臟應(yīng)該最好不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗(yàn)證試驗(yàn)的值和其他出版和私有數(shù)據(jù)。目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)對其他組織的最佳或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測試報(bào)告應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)或?qū)S袛?shù)據(jù),對彗星試驗(yàn)在這些組織中的性能進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶彶椤J紫,在對照組中,需要一個(gè)較低的%尾DNA范圍,以提供足夠的動態(tài)范圍來檢測陽性的影響。其次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)能夠按照表1所建議的不同方式,對直接誘變劑和促進(jìn)劑的反應(yīng)。
表一:陽性對照物質(zhì)及其部分靶組織
陽性對照物 |
靶組織 |
Ethyl methanesulfonate |
任何組織 |
Methyl methanesulfonate |
肝臟、胃、十二指腸或空腸,肺和支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞,腎臟,膀胱,肺,睪丸和骨骼骨髓/ |
Ethyl nitrosourea |
肝胃,十二指腸或空腸 |
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine |
胃、十二指腸或空腸 |
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl |
肝臟和腸 |
N-methyl-N-nitrosourea |
肝臟,骨髓,血液,腎臟,胃、空腸和大腦。 |
應(yīng)收集陰性對照數(shù)據(jù),以證明陰性數(shù)據(jù)反應(yīng)的再現(xiàn)性,并確保對檢測的技術(shù)方面進(jìn)行適當(dāng)控制,或建議需要重新建立歷史控制范圍。
歷史對照
在實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證過程中,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立歷史數(shù)據(jù)庫,建立相關(guān)組織和物種的陽性和陰性對照范圍和分布。不同的組織和不同的物種,以及不同的給藥溶媒和給藥途徑,可能會產(chǎn)生不同的%尾DNA陰性對照值。因此,建立每個(gè)組織和物種的陰性對照范圍是很重要的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用質(zhì)量控制方法,以確定其數(shù)據(jù)的變化程度,并表明該方法在其實(shí)驗(yàn)室中得到了“控制”?赡苓需要優(yōu)化選擇適當(dāng)?shù)年栃詫φ瘴镔|(zhì)、劑量范圍和實(shí)驗(yàn)條件(例如電泳條件),以便發(fā)現(xiàn)微弱的影響。
對實(shí)驗(yàn)方案的任何更改都應(yīng)根據(jù)其與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有歷史控制數(shù)據(jù)庫的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應(yīng)導(dǎo)致建立新的歷史控制數(shù)據(jù)庫。
方法描述
動物選擇:通常使用健康成年嚙齒動物(6-10周齡,但年齡稍大的動物也可接受)。
動物準(zhǔn)備:動物隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。在開始實(shí)驗(yàn)前,這些動物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件至少5天,給予標(biāo)識識別。試驗(yàn)開始時(shí),動物的重量差異應(yīng)該不超過±20%。
樣品制備:在給動物給藥前,固體測試化學(xué)品應(yīng)溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)娜苊街校蚧旌显陲嬍郴蝻嬘盟。液體試驗(yàn)化學(xué)品可直接加藥或在加藥前稀釋。對于吸入暴露,根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì),試驗(yàn)化學(xué)品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。
溶媒:在使用的劑量范圍內(nèi),溶媒不應(yīng)產(chǎn)生毒性作用,也不應(yīng)與試驗(yàn)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用的不是常用溶媒應(yīng)提供參考數(shù)據(jù),說明它們在測試動物、管理路線和終點(diǎn)方面的兼容性。建議在可能的情況下,應(yīng)首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是,一些溶劑可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平,尤其是與多藥給藥時(shí)。
陰性對照:陰性對照動物,單獨(dú)用溶媒處理,其他處理方法與治療組相同,每一次采樣時(shí)間和組織的每次檢測均納入一組陰性對照動物。陰性對照動物的尾部DNA應(yīng)在每個(gè)組織預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)室背景范圍和該物種的取樣時(shí)間內(nèi)。
動物數(shù)量和性別:目標(biāo)是每組提供至少5只可分析的單性別動物,或如果使用兩種動物,則每組至少提供5只可分析的單性別動物。如果人類接觸到的化學(xué)物質(zhì)可能具有性別特異性,例如某些藥物,則應(yīng)在適當(dāng)?shù)男詣e下進(jìn)行檢測。三個(gè)劑量組和同時(shí)進(jìn)行的陰性和陽性對照(每一組由5只單性別動物組成),將需要25至35只動物。
試驗(yàn)計(jì)劃:動物應(yīng)接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時(shí)進(jìn)行兩次或兩次以上),并在最后一次治療后的2-6小時(shí)采集一次樣本。延長劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測試化學(xué)品也可以分次使用,即,兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時(shí),便于給藥量大。在這種情況下,取樣時(shí)間應(yīng)根據(jù)最后一次給藥的時(shí)間來安排。
劑量水平:對無毒試驗(yàn)化學(xué)品,給藥14天以上的,最大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時(shí)間少于14天,最高劑量為2000毫克/公斤體重/天。
采樣時(shí)間:采樣時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵變量,因?yàn)樗怯蓽y試化學(xué)物質(zhì)在目標(biāo)組織中達(dá)到最大濃度所需的時(shí)間和DNA鏈斷裂的誘導(dǎo)時(shí)間決定的,但在這些斷裂被移除、修復(fù)或?qū)е录?xì)胞死亡之前。
組織收集:因?yàn)樗梢匝芯空T導(dǎo)的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應(yīng)清晰、基于收集的原因進(jìn)行研究與任何現(xiàn)有的基因毒性、致癌性或其他測試物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)在調(diào)查之中。應(yīng)考慮的重要因素應(yīng)包括給藥途徑、預(yù)測的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗(yàn)物質(zhì)可能的作用機(jī)制。肝臟是研究最頻繁、數(shù)據(jù)最豐富的組織。因此,在缺乏任何背景信息的情況下,如果沒有確定感興趣的特定組織,那么對肝臟進(jìn)行取樣是合理的,因?yàn)楦闻K是異種生物代謝的主要場所,而且常常高度暴露于母體物質(zhì)和代謝物中。在某些情況下,直接接觸部位的檢查(例如,口服藥物,胃腺或十二指腸/空腸,或吸入藥物,肺)可能是最相關(guān)的。應(yīng)根據(jù)進(jìn)行測試的具體原因選擇其他或替代組織,但如果實(shí)驗(yàn)室已證明對這些組織的熟練程度和同時(shí)處理多個(gè)組織的能力,對同一動物的多個(gè)組織進(jìn)行檢查可能是有用的。
樣本制備:在最后一次用測試化學(xué)品后的適當(dāng)時(shí)間,對動物實(shí)施安樂死。收集選定的組織,而同時(shí)采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當(dāng)?shù)墓潭▌┛赡芙M織病理學(xué)分析。彗星實(shí)驗(yàn)的組織被放置在切碎緩沖液中,用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液,并儲存在冰冷的切碎緩沖液中,直到處理完畢。原位灌注也可進(jìn)行,如肝、腎灌注。
玻片準(zhǔn)備:單細(xì)胞懸液制備后,應(yīng)盡快(最好在1小時(shí)內(nèi))制備載玻片,但動物死亡與載玻片制備之間的溫度和時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制,并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行驗(yàn)證。向低熔點(diǎn)瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細(xì)胞懸浮液的體積,使玻片的低熔點(diǎn)瓊脂糖百分比不應(yīng)降低到0.45%以下。最佳的細(xì)胞密度將由用來給彗星評分的圖像分析系統(tǒng)決定。
細(xì)胞裂解:裂解條件也是一個(gè)關(guān)鍵變量,可能會干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此,我們建議在實(shí)驗(yàn)中對所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準(zhǔn)備好后,應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光),將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(shí)(或過夜),以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后,在堿液展開步驟之前,應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。
解旋和電泳:將載玻片隨機(jī)放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺上,使載玻片表面完全覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。在其他類型的彗星試驗(yàn)電泳裝置,即主動冷卻,循環(huán)和高容量電源,較高的解決方案覆蓋將導(dǎo)致更高的電流,而電壓保持不變。
測量方法:彗星應(yīng)該使用自動化或半自動化的圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量評分。用合適的熒光染色劑對載玻片進(jìn)行染色,并在配備有超熒光和適當(dāng)檢測器的顯微鏡或數(shù)碼相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)放大(如200x)的測量。
根據(jù)彗星圖像圖譜的描述,細(xì)胞可以分為三種類型,即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細(xì)胞(明確定義的頭部和尾部,不干擾相鄰的細(xì)胞)應(yīng)該為%的尾部DNA,以避免人為干擾。刺猬的頻率應(yīng)該根據(jù)每個(gè)樣本至少150個(gè)細(xì)胞的視覺評分(因?yàn)槿鄙僖粋(gè)清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測到)來確定,并單獨(dú)記錄下來。
所有用于分析的玻片,包括陽性和陰性對照的玻片,都應(yīng)獨(dú)立編碼并進(jìn)行“盲法”評分,以便評分者不知道情況。對于每個(gè)樣本(每個(gè)動物的每個(gè)組織),至少應(yīng)該分析150個(gè)細(xì)胞(刺猬除外)。分析150細(xì)胞/動物至少5動物每劑,提供足夠的統(tǒng)計(jì)能力。
彗星DNA鏈斷裂可以通過尾DNA %、尾長和尾力矩等獨(dú)立端點(diǎn)來測量。如果使用適當(dāng)?shù)膱D像軟件分析儀系統(tǒng),就可以進(jìn)行這三種測量。然而,推薦將%尾DNA(也稱為%尾強(qiáng)度)用于結(jié)果的評估和解釋,并由以細(xì)胞總強(qiáng)度百分比表示的尾DNA片段強(qiáng)度決定。
數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
在實(shí)驗(yàn)條件下,陽性對照組的尾DNA%的與陰性對照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加(p<0.05)時(shí),判定試驗(yàn)系統(tǒng)有效。
在試驗(yàn)系統(tǒng)判定有效的前提下,同時(shí)滿足以下三個(gè)條件,則判定受試樣品為陽性結(jié)果:
(1) 尾DNA%的在某個(gè)單獨(dú)劑量組顯著升高;
(2) 尾DNA%隨試驗(yàn)樣品濃度升高有顯著增加趨勢;
(3) 受試物組的尾DNA%全部超過陰性背景數(shù)據(jù)范圍。
在判定陽性結(jié)果時(shí),如僅符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或兩個(gè),除統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,還應(yīng)考慮其生物學(xué)意義。
如全部不符合上述3個(gè),則判定為陰性結(jié)果。
彗星試驗(yàn)試劑盒
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對堿性彗星試驗(yàn)開發(fā)試劑盒,本試劑盒省去了試驗(yàn)溶劑配制、溶膠配制不穩(wěn)定等時(shí)間,可以直接使用,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期;試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測,符合堿性彗星試驗(yàn)要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。堿性彗星試劑盒應(yīng)用廣泛,可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測。
【產(chǎn)品說明】
本試劑盒提供了單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)需要的試劑和耗材。
試劑名稱 規(guī)格 數(shù)量 儲存條件
包裝盒 |
產(chǎn)品組成 |
規(guī)格 |
數(shù)量 |
保存條件 |
堿性彗星實(shí)驗(yàn)盒 |
細(xì)胞裂解液 |
500 mL |
1 |
室溫 |
電泳膠A |
10 mL |
1 |
室溫 |
電泳膠B |
15 mL |
1 |
4℃ |
玻片 |
2孔 |
30 |
室溫 |
200 mM EDTA, PH 10 |
12.5mL |
1 |
室溫 |
核酸染料 |
10 ul |
1 |
4℃ |
DMSO |
50 mL |
1 |
室溫 |
- 細(xì)胞裂解液避免了多成分配制的繁瑣工藝,保證了每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解的穩(wěn)定性。
- 電泳膠經(jīng)過采用先進(jìn)工藝規(guī);苽,出廠前經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測,實(shí)驗(yàn)時(shí)直接溶解即可使用。
- 針對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩孔式玻片增加了溶膠的粘附性,使細(xì)胞完整,便于拍照分析。
【試劑盒應(yīng)用范圍】
本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣,可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測。
【傳統(tǒng)試驗(yàn)操作不足】
- 溶液配制繁瑣,每次配制裂解效果不同。
- 不同膠濃度會影響DNA尾百分?jǐn)?shù),過低濃度的膠穩(wěn)定性差,過高濃度的膠會抑制彗星尾的產(chǎn)生,且反復(fù)溶膠會導(dǎo)致儲備液蒸發(fā),影響試驗(yàn)結(jié)果。
- 傳統(tǒng)玻片對溶膠的粘附性較低,且溶膠易流出玻片,損失較大。
【試劑盒優(yōu)勢】
便捷——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒省去了裂解液配制時(shí)間,可以直接使用,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
準(zhǔn)確——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定——匯智泰康彗星試驗(yàn)試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。