生物醫(yī)藥領(lǐng)域的黑馬：CRISPR/Cas9 技術(shù)
優(yōu)秀的基因編輯技術(shù)
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)深受研究人員的喜愛，那么它為什么如此優(yōu)秀呢？
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)；Cas9（CRISPR associated nuclease）是CRISPR相關(guān)核酸酶，CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)的，利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術(shù)。CRISPR系統(tǒng)是一種原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，當(dāng)gRNA 和Cas9在活細(xì)胞中表達時，CRISPR-Cas9/sgRNA復(fù)合物通過gRNA與基因組DNA的互補堿基配對被招募到靶序列，一旦復(fù)合物定位到靶DNA，Cas9蛋白就會極其精確地切割所需區(qū)域，導(dǎo)致雙鏈斷裂(DSB)，然后，Cas9產(chǎn)生的DSB被細(xì)胞自身的細(xì)胞內(nèi)源性DNA修復(fù)機制修復(fù)：非同源末端連接(NHEJ)DNA修復(fù)途徑或同源定向修復(fù)(HDR)途徑。
圖1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯機制[1]
CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡單，基因編輯效率較高，無物種限制，實驗周期短，故在生物學(xué)領(lǐng)域方面得到了廣泛的應(yīng)用，該系統(tǒng)在精確基因打靶和糾正某些疾病中不需要的突變方面具有巨大的應(yīng)用前景，基于CRISPR的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)成為多種疾病的重要潛在治療工具。接下來小編帶大家簡單了解下CRISPR/Cas9技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用。
疾病治療領(lǐng)域應(yīng)用
肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展涉及多個基因和信號通路，肺癌的治療方法一直是臨床研究的熱點，化療和靶向藥（如EGFR、ALK、KRAS等靶點）治療的耐藥性越來越成為令人擔(dān)憂的問題。肺癌細(xì)胞基因組修復(fù)和特異性蛋白表達沉默已成為研究和治療肺癌的重要手段。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)全面分析肺癌患者個體，可以在該平臺上快速識別基因型特異性缺陷；這種方法還可以模擬給予患者的治療，以迅速揭示特定抗癌藥物的耐藥機制，并幫助確定有效的治療方法，以永久糾正癌癥相關(guān)基因突變。
圖2 CRISPR/Cas9 在肺癌治療研究中的應(yīng)用
大顯身手--NK細(xì)胞癌癥免疫治療的基因重編程自然殺傷細(xì)胞是強大的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，專門識別和消除轉(zhuǎn)化細(xì)胞，協(xié)調(diào)適應(yīng)性抗腫瘤免疫。然而，NK細(xì)胞通常在腫瘤微環(huán)境中功能耗竭。CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展提供了一種靈活和有效的基因編輯能力，可調(diào)節(jié)介導(dǎo)NK細(xì)胞耗竭的各種途徑，利用CRISPR/Cas9技術(shù)使目的基因（通過同源導(dǎo)向修復(fù)途徑與供體基因）易于位點特異性整合，通過敲除免疫檢查點和抑制信號，對各種來源的NK細(xì)胞（PBNK：外周血NK細(xì)胞；UCB：臍帶血；hESCs：造血胚胎干細(xì)胞；iPSCs：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；NK-92：NK-92細(xì)胞系）進行基因編輯，通過攜帶嵌合抗原受體增強其腫瘤特異性，通過整合組織歸巢受體支持其腫瘤浸潤，通過提供額外的激活信號改善其抗腫瘤活性，以及通過拮抗抑制途徑，改善NK細(xì)胞腫瘤監(jiān)測作用[3]。
圖3 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 NK 細(xì)胞遺傳重編程的示意圖
組件體內(nèi)遞送系統(tǒng)
值得注意的是大多數(shù)疾病需要CRISPR組件在體內(nèi)遞送，因此，CRISPR組件的靶向遞送和特定位點的有效編輯仍然是體內(nèi)治療性基因編輯的主要內(nèi)容，遞送系統(tǒng)可以保護CRISPR組件免受RNA酶、蛋白酶和溶酶體的降解，它們能夠?qū)RISPR組件遞送到特定位點，并最大限度地減少不需要的副作用，慢病毒和腺病毒等病毒載體已經(jīng)實現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)遞送的高效率，但由于可能存在不必要的基因突變、插入突變、高脫靶效應(yīng)、包裝容量受限、致癌作用和免疫原性等問題使其發(fā)展受限，基于納米顆粒的遞送方法由于其特異性靶向性、高效率、定制的有效性、對免疫反應(yīng)的微小刺激和對核酸酶的最小暴露而在基因治療中越來越受到人們的關(guān)注，一些基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合物納米顆粒和金納米粒子等取得了較好的研究效果，下圖為臨床試驗中CRISPR遞送的潛在非病毒載體[4]。
總之，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組編輯方面顯示出了巨大的潛力，隨著未來相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)將會發(fā)揮更多的作用，創(chuàng)造更大的價值。
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參考資料
[1]Cribbs, Adam P. and Sumeth M. W. Perera. “Science and Bioethics of CRISPR-Cas9 Gene Editing: An Analysis Towards Separating Facts and Fiction.” The Yale journal of biology and medicine(2017).
[2]Jiang, C., Lin, X., & Zhao, Z. (2019). Applications of CRISPR/Cas9 Technology in the Treatment of Lung Cancer. Trends in Molecular Medicine.
[3]Afolabi, L. O., Adeshakin, A. O., Sani, M. M., Bi, J., & Wan, X. (2019). Genetic Reprogramming For NK cell Cancer Immunotherapy with CRISPR /Cas9. Immunology.
[4]Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2019 Dec 2:e1609.doi: 10.1002/wnan.1609.
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