學(xué)會正確地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，然而小心翼翼的你，怎奈何體外細(xì)胞的脆弱，百密終有一疏。你偶然的一個噴嚏，不經(jīng)意得捋捋你的頭發(fā)絲，對于這些丟失體外抵抗能力的細(xì)胞都可能是毀滅性的災(zāi)害。但是，并非所有的細(xì)胞污染都是致命的，若是及時(shí)發(fā)現(xiàn)，還是可以得到挽救的。今天咱們的主題就是：教大家辨別各種細(xì)胞污染及如何應(yīng)對。

如下圖：實(shí)驗(yàn)室常見的細(xì)胞污染，你都知道屬于哪種污染嗎？

細(xì)胞培養(yǎng)中的常見污染主要包括：細(xì)菌、霉菌、支原體、黑膠蟲、病毒和交叉污染等，每一種污染都有各自的特點(diǎn)。如細(xì)菌和霉菌增殖迅速，短時(shí)間就對細(xì)胞造成明顯傷害；而支原體和病毒對細(xì)胞的影響則是一種緩慢長期的過程。下面就具體看看每一種污染。

1. 細(xì)菌污染（較容易被發(fā)現(xiàn)）

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；

細(xì)菌污染種類：白色葡萄球菌，大腸桿菌，假單孢菌、枯草桿菌等；

細(xì)胞污染后的變化：

①污染后由于有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，因此培養(yǎng)基會短時(shí)間內(nèi)由紅色變?yōu)辄S色；

②由于細(xì)菌大量增殖，培養(yǎng)基變渾濁，稍微振蕩后可見培養(yǎng)基表面有漂浮物；

③普通倒置顯微鏡高倍鏡觀察，胞漿內(nèi)可見大量顆粒（如下圖紅色箭頭）；

④細(xì)胞生長緩慢，逐漸變圓脫落。

如下圖所示：左：懸浮細(xì)胞污染后，可見懸浮細(xì)胞個體遠(yuǎn)大于桿狀細(xì)菌，而細(xì)菌呈黑色顆粒狀并會有較快的運(yùn)動速度；右：貼壁細(xì)胞，可看到球狀細(xì)菌分布于細(xì)胞周圍并做劇烈運(yùn)動。

細(xì)菌污染的細(xì)胞（左懸浮細(xì)胞，右貼壁細(xì)胞）

圖片來源：UNC School of Medicine

處理措施：

• 在培養(yǎng)液中添加雙抗（P/S）處理；可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規(guī)培養(yǎng)液；

• 另外添加西司他丁鈉和亞胺培南（泰能）處理細(xì)胞，適用于培養(yǎng)用具被打翻、使用了污染的培養(yǎng)液或要培養(yǎng)污染的組織或者凍存細(xì)胞的污染情況[1]。

• 裸鼠體內(nèi)接種法是比較有效和徹底的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細(xì)胞。既能徹底清除污染細(xì)菌，又能保持腫瘤細(xì)胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細(xì)胞，可采用裸鼠體內(nèi)接種法[2]。

2. 霉菌污染（較容易被發(fā)現(xiàn)）

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；

污染種類：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；

細(xì)胞污染后的變化：

①一般來說，培養(yǎng)液不會變渾濁；

②比較容易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見點(diǎn)狀菌落（淡黃色或者白色）漂浮在培養(yǎng)基表面（如下圖左）；

③普通倒置顯微鏡下觀察，可見絮狀交錯的菌絲或菌團(tuán)生長在細(xì)胞之間；有時(shí)真菌并不是直接分布于細(xì)胞貼壁層，需要通過調(diào)整顯微鏡仔細(xì)觀察尋找菌絲或菌團(tuán)（如下圖右）。

如下圖所示：懸浮細(xì)胞U397的霉菌污染，黃色圓形發(fā)亮的是U397；紅色箭頭：霉菌的菌絲和孢子囊，特別的是孢子釋放出來后是難以被酒精殺死。

霉菌污染后的懸浮細(xì)胞（圖片來源InCelligence網(wǎng)站）

處理措施：

• 添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細(xì)胞的毒性也較大；

• 環(huán)境徹底消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養(yǎng)箱；水盤加上飽和量的硫酸銅。

• 若細(xì)胞不是特別珍貴，建議丟棄。

3. 支原體污染（難被發(fā)現(xiàn)）

支原體是一種自然界中能獨(dú)立生活的最小微生物，能通過細(xì)菌濾器，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率很高[3]。由于支原體可以與細(xì)胞共存，生長速率受影響較小，而被忽視。支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)污染中最為隱蔽和最難察覺，但是支原體能明顯影響宿主細(xì)胞代謝、RNA合成及基因表達(dá)的作用，因此越來越受到重視。

引起原因：主要來源于是已感染支原體細(xì)胞之間的交叉污染，支原體感染的血清和胰酶等；

細(xì)胞污染后的變化：

①培養(yǎng)液不變渾濁，但會很快變成黃色；

②多數(shù)細(xì)胞在形態(tài)方面少有明顯變化；

③在倒置顯微鏡下可見胞漿出現(xiàn)小顆粒或空泡；

如下圖：支原體個體很小，需要使用透射電鏡才能清晰看到其結(jié)構(gòu)及分布，圖中紅色箭頭即為支原體，其分布在細(xì)胞周圍。

支原體污染后的透射電鏡圖[4]

處理措施：

• 定期用支原體試劑盒檢測；

• 換液可以減緩污染情況，但無法根除；

• 支原體清除試劑盒可以達(dá)到較好效果；

• 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法。

4. 黑膠蟲污染

引起原因：往往來源于血清；

細(xì)胞污染后的變化：

①低倍鏡下觀察時(shí)可見黑色小點(diǎn)，高倍鏡下可見到其做布朗運(yùn)動，像小蟲游來游去；

②細(xì)胞培養(yǎng)液仍然清亮，污染較輕時(shí)對細(xì)胞無影響；若太多就會對細(xì)胞造成影響。

如下圖：紅色箭頭所示黑膠蟲分布于細(xì)胞間。

黑膠蟲污染后的細(xì)胞[5]

處理措施：

• 更換血清；增加細(xì)胞密度，提高細(xì)胞的生長率。

5. 病毒污染

引起原因：病毒可能來自于血清；

細(xì)胞污染后的變化：

①污染后培養(yǎng)液無明顯變化；

②大部分細(xì)胞也不會有明顯的形態(tài)變化；

6. 交叉污染

引起原因：兩種或兩種細(xì)胞以上的實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)器具、試劑等混用而易造成的污染；

檢測手段：可通過鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)是否與所培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)一致來判斷，另外還可以通過各種免疫學(xué)試驗(yàn)、同功酶分析及細(xì)胞遺傳學(xué)方法來確定。

處理方式：針對病毒和交叉污染較難清除，建議丟棄細(xì)胞重新培養(yǎng)；

看到這里，文章開頭的那幾張圖片代表著什么污染，你能辨別了嗎？可以在下方給我們留言，看看你是否掌握了這項(xiàng)技能哦！

學(xué)會對各種污染情況的辨別和處理是一項(xiàng)不可或缺的實(shí)驗(yàn)技能，希望大家在看完我們的文章后結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)會如何應(yīng)對細(xì)胞污染。

參考文獻(xiàn)：

1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁鈉+亞胺培南消除細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌污染的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(1):114-115.

2.王鴻、張偉、孟娜. 細(xì)胞培養(yǎng)中珍貴貼壁細(xì)胞污染挽救方法的評價(jià)[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011,26 (1):1006-7795.

3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.

4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas.  DOI: 10.5772/51518

5.辛顏彬．細(xì)胞培養(yǎng)污染的發(fā)生、預(yù)防及清除［J］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1989，13( 6):468-470．