瘧疾是一種威脅生命的疾病，通過被原生動物寄生蟲感染的蚊子叮咬傳播。最常見和最危險的瘧疾類型是惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）引起的瘧疾。瘧疾引起了嚴(yán)重關(guān)切，因為世界上有一半的人口處于這種危險之中，而且迄今為止還沒有有效疫苗。2016年，世界衛(wèi)生組織報告了2.16億例[1]，其中50萬人死亡，由瘧疾造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過了數(shù)十億美元。

 

圖1. 瘧原蟲對紅細(xì)胞的侵襲示意圖

 

在細(xì)胞水平，惡性瘧原蟲對紅細(xì)胞的感染引發(fā)了該疾病的臨床癥狀。該階段涉及高度動態(tài)的蛋白質(zhì)間的相互作用，由于它們的復(fù)雜性，目前仍然知之甚少。澳大利亞墨爾本大學(xué)Cowman等利用SP8 STED納米顯微鏡和特定蛋白的條件表達(dá)，確定了在入侵階段的關(guān)鍵蛋白復(fù)合物。形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)能夠使宿主-病原體相連接，并且復(fù)合物的存在是宿主-病原體緊密連接和紅細(xì)胞Ca2+釋放所必需的（圖1）。這一突破發(fā)表在Cell Host＆Microbe雜志上[2]。

 

瘧疾感染的主要參與者

 

圖2：瘧原蟲生命周期的三個主要階段：肝臟階段，血液階段和載體階段。綠色圓圈顯示寄生蟲從載體到宿主、從宿主到載體的關(guān)鍵入口點。圖片來源[3]。

 

進(jìn)入人類宿主后，隨著瘧疾的發(fā)展，瘧原寄生蟲在其生命周期中以不同的形式存在（圖2）。在所謂的血液階段[4]，以裂殖子形式存在于紅細(xì)胞，通過不同階段進(jìn)化，感染的宿主細(xì)胞中會產(chǎn)生約30個子代裂殖子，并準(zhǔn)備入侵其他細(xì)胞。裂殖子入侵是寄生蟲在血流中傳播和疾病發(fā)作的關(guān)鍵。盡管如此，該疾病的分子機(jī)制尚不清楚。

 

為了侵入紅細(xì)胞，裂殖子必須首先與宿主細(xì)胞接觸，即所謂的“入侵前”階段[5]，使紅細(xì)胞膜變形，裂殖子配體與膜中的特定受體結(jié)合，形成緊密連接，并觸發(fā)Ca2+流。Ca2+的流動似乎對細(xì)胞侵襲很重要。寄生蟲與細(xì)胞的附著變得不可逆轉(zhuǎn)，并在不到2分鐘內(nèi)進(jìn)入紅細(xì)胞。

 

惡性瘧原蟲紅細(xì)胞結(jié)合蛋白同源物（PfRh）和紅細(xì)胞結(jié)合類蛋白是參與入侵的重要信號[6]。PfRh家族的關(guān)鍵成員是PfRh5，其與宿主蛋白受體basigin結(jié)合可以誘導(dǎo)Ca2+釋放到紅細(xì)胞中，并標(biāo)志著裂殖子和血細(xì)胞膜的橋連通道的形成。PfRh5對于裂殖子侵入至關(guān)重要，正如抗體或可溶性basigin抑制紅細(xì)胞感染的研究所示[7]。PfRh5與PfRh5相互作用蛋白（PfRipr）和富含半胱氨酸的保護(hù)性抗原（CyRPA）一起發(fā)揮作用，但這種相互作用的功能尚不清楚。了解PfRh5/PfRipr/CyRPA的作用非常重要，因為這些蛋白質(zhì)是開發(fā)抑制血液中瘧疾發(fā)展的疫苗的重要候選者[8]。

 

用正確的工具尋找瘧疾感染的答案

 

視頻1 PfRipr缺失的裂殖子試圖感染紅細(xì)胞

 

Cowman等開展了轉(zhuǎn)基因惡性瘧原蟲系的研究工作，分別敲除PfRipr和CyRPA的基因，RiprloxCre和CyRPAloxCre[2]。在含有RiprloxCre和CyRPAloxCre基因的寄生蟲加入重組酶（雷帕霉素誘導(dǎo)的DiCre）以快速且非常有效地調(diào)節(jié)基因缺失，從而相應(yīng)地控制兩種蛋白質(zhì)水平。作者還進(jìn)行了活細(xì)胞成像，并確認(rèn)PfRipr和CyRPA在與宿主細(xì)胞初次接觸后對紅細(xì)胞侵襲至關(guān)重要。在沒有PfRipr或CyRPA的情況下，宿主細(xì)胞膜仍然變形，但缺乏Ca2+流動，因此寄生蟲不能進(jìn)入血細(xì)胞（視頻1）。

 

SP8 STED納米顯微鏡發(fā)現(xiàn)未知

 

接下來，Cowman等研究了入侵期間的PfRh5、PfRipr和CyRPA的定位[2]。共聚焦成像顯示三種蛋白質(zhì)在寄生蟲頂端優(yōu)先定位，該區(qū)域優(yōu)先與宿主細(xì)胞接觸。然而，對于生物分子的空間分布的精確評估只可能發(fā)生于低于顯微成像3/4衍射極限的分辨率水平上，2D通常低于30nm、3D STED（受激發(fā)射損耗）通常低于100nm。為此，將紅細(xì)胞與裂殖子一起孵育以誘導(dǎo)入侵并用抗體探針對靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記。樣品被放置于Leica TCS SP8 STED納米顯微鏡上進(jìn)行2D和3D超高分辨成像（775nm，視頻2）。為了進(jìn)一步確定入侵的初始階段，研究人員還對RON4進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記，RON4是定位于寄生蟲頂端的蛋白質(zhì)（圖3）。

 

圖3：侵入紅細(xì)胞的裂殖子的STED納米檢測。3D STED圖像顯示RON4（品紅色）與蛋白質(zhì)PfRh5（上圖左，綠色）、PfRipr（中，綠色）、PfCyRPA（右，綠色）的疊加。DAPI核染色顯示為藍(lán)色，紅細(xì)胞膜顯示為灰色。比例尺為1μm。圖片由Walter和Eliza Hall醫(yī)學(xué)研究Alan Cowman教授。

 

視頻2 裂殖子入侵紅細(xì)胞早期的STED 3D構(gòu)建

 

用SP8 STED獲得的空間信息顯示PfRh5、PfRipr和CyRPA在寄生蟲頂端進(jìn)行共定位，其中也發(fā)現(xiàn)了RON4的存在（視頻2）。單個蛋白質(zhì)和PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr二聚體復(fù)合物在裂殖子膜上表現(xiàn)出拼接分布，與頂端末端的釋放一致。使用2D STED進(jìn)行更近、更高分辨率的成像證實PfRipr和CyRPA在裂殖子上擴(kuò)散，但特別局限于頂端。對PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr的共定位程度的評估顯示，PfRh5/PfRipr的比例更大。該發(fā)現(xiàn)表明CyRPA/PfRipr擴(kuò)散到裂殖子表面上，隨后PfRh5/CyRPA/PfRipR復(fù)合物直接在表面頂端聚集以結(jié)合basigin，然后觸發(fā)緊密連接的形成，并進(jìn)入入侵感染的下一步。單個PfRh5、PfRipr和CyRPA的出現(xiàn)也表明，每種蛋白質(zhì)仍可用于合成復(fù)合物。

 

圖3：PfRipr在侵入紅細(xì)胞的裂殖子上的定位。用WGA（綠色）染色的紅細(xì)胞膜。左為共聚焦圖像，使用2D STED（MIP）可視化PfRipr。DAPI（藍(lán)色）。白條表示1μm。

 

展望

 

 

對紅細(xì)胞的侵入是人類宿主中瘧疾感染的關(guān)鍵階段。直到最近，對所涉及的蛋白質(zhì)的相互作用和功能的研究是有限的，因為關(guān)鍵配體PfRh5的抑制完全抑制感染的的入侵。使用PfRipr和CyRPA的條件表達(dá)和STED納米顯微成像，Cowman等揭示了PfRipr、CyRPA和PfRh5/PfRipr/CyRPA復(fù)合物在裂殖子入侵中的重要作用[2]。通過復(fù)合物與宿主受體basigin的結(jié)合，蛋白質(zhì)參與Ca2+釋放到紅細(xì)胞中。SP8 STED納米顯微鏡提供了必要的分辨率，以顯示PfRh5/PfRipr/CyRPA復(fù)合物在寄生蟲和宿主細(xì)胞之間界面處的形成。以前的研究表明，CyRPA將復(fù)合物與寄生蟲膜相連[8]，但Cowman組進(jìn)行了額外的生化分析，結(jié)果顯示情況并非如此。相反，結(jié)果表明其他蛋白質(zhì)必須將復(fù)合物錨定到宿主細(xì)胞并指導(dǎo)它在頂端的形成。

 

未來的工作將有助于找到參與裂殖子/宿主細(xì)胞相互作用的新蛋白質(zhì)，并了解Ca2+釋放在感染途徑中的功能作用。最終，解剖宿主和病原體之間的相互作用將有助于找到更有效的方法來對抗瘧疾。

 

參考文獻(xiàn)

 

1. World Health Organization (WHO), World Malaria Report 2017 (WHO, Geneva, Switzerland, 29 November 2017)

 

2. Volz JC, Yap A, et al. (2016) Essential Role of the PfRh5/PfRipr/CyRPA Complex during Plasmodium falciparum Invasion of Erythrocytes, Cell Host Microbe 20 (1), 60-71, DOI: 10.1016/j.chom.2016.06.004

 

3. Delves M, Plouffe D, et al. (2012) The Activities of Current Antimalarial Drugs on the Life Cycle Stages of Plasmodium: A Comparative Study with Human and Rodent Parasites. PLoS Med 9(2): e1001169. DOI:10.1371/journal.pmed.1001169

 

4. Cowman, A.F., Crabb, B.S. (2006) Invasion of red blood cells by malaria parasites, Cell 124, 755–766, DOI: 10.1016/j.cell.2006.02.006

 

5. Weiss GE, Gilson PR, et al. (2015) Revealing the sequence and resulting cellular morphology of receptor-ligand interactions during Plasmodium falciparum invasion of erythrocytes. PLoS Pathog 11 (2), e1004670, DOI:      10.1371/journal.ppat.1004670

 

6. Tham WH, Healer J, et al. (2012) Erythrocyte and reticulocyte binding-like proteins of Plasmodium falciparum. Trends Parasitol 28 (1), 23–30, DOI: 10.1016/j.pt.2011.10.002

 

7. Chen L, Lopaticki S, et al. (2011) An EGF-like protein forms a complex with PfRh5 and is required for invasion of human erythrocytes by Plasmodium falciparum. PLoS Pathog 7 (9), e1002199, DOI: 10.1371/journal.ppat.1002199

 

8. Douglas AD, Baldeviano GC, et al. (2015) A PfRH5-based vaccine is efficacious against heterologous strain blood-stage Plasmodium falciparum infection in Aotusmonkeys, Cell Host Microbe 17 (1), 130–139,

DOI: 10.1016/j.chom.2014.11.017

 

9. Reddy KS, Amlabu E, et al. (2015) Multiprotein complex between the GPI-anchored CyRPA with PfRH5 and PfRipr is crucial for Plasmodium falciparum erythrocyte invasion, Proc. Natl Acad Sci USA 112 (4), 1179–1184,

DOI: 10.1073/pnas.1415466112

 

 

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