過氧化氫含量（H2O2）試劑盒使用說明書
過氧化氫含量（H2O2）試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：
H2O2 是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，主要由 SOD 和 XOD 等催化產(chǎn)生，由 CAT 和 POD 等催化降解。H2O2 不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2 可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體；另一方面H2O2 也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，。
測定原理：
H2O2 與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物，在 415nm 有特征吸收。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、丙酮 100mL、濃鹽酸 5mL、研缽和冰。
試劑的組成和配制：
試劑一：丙酮 100mL×1 瓶，4℃保存；（自備）
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑 4℃保存；(溶解時間較長，約 30min，可 40℃-60℃加熱，務(wù)必提前準備)
試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑四：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；
H2O2 提取：
1、細菌或細胞樣品的制備：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30次）；用試劑一定容至 1mL；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2. 組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約
0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)移至 EP 管中，用試劑一定容至 1mL，8000g
4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟
1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 415nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二、三和四 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。
3、在 EP 管中按順序加入下列試劑
|
試劑名稱（μL） |
測定 |
對照 |
|
樣本 |
250 |
|
|
試劑一 |
|
250 |
|
試劑二 |
25 |
25 |
|
試劑三 |
50 |
50 |
4000g，25℃離心 10min，棄上清，留沉淀
|
試劑四 |
250 |
250 |
加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置 5min，取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中測定
415nm 處吸光值 A。對照管只要做一次即可。計算 ΔA＝A 測定-A 對照。
注意事項：
1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預(yù)冷再加，研磨時必須在冰上研磨。
2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請帶一次性手套和口罩。
H2O2 含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定的回歸曲線，y = 0.7488x + 0.0006 (x 為標準品濃度，μmol/mL；y 為 ΔA)。
2、血清（漿）中 H2O2 含量的計算：
H2O2 含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)
3、細菌、細胞或動物組織中H2O2 含量計算
（1） 按照蛋白濃度計算
H2O2 含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
（2） 按照樣本質(zhì)量計算
H2O2 含量(μmol/g 鮮重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算：
H2O2 含量(μmol/104)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定的回歸曲線，y = 0.3744x + 0.0006 (x 為標準品濃度，μmol/mL；y 為 ΔA)。
2、血清（漿）中 H2O2 含量的計算：
H2O2 含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)
3、細菌、細胞或組織中 H2O2 含量計算
（1） 按照蛋白濃度計算
H2O2 含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
（2） 按照樣本質(zhì)量計算
H2O2 含量(μmol/g 鮮重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算：
H2O2 含量(μmol/104)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。
注意：標曲線性范圍為 0.1μmol/mL-2μmol/mL，吸光度 ΔA 線性范圍為 0.03-1，若 ΔA 超過
1 則需要稀釋，計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
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