一、認(rèn)識(shí)shRNA：

 

在研究基因功能中，RNAi由于可以特異性地使基因沉默或表達(dá)量降低而成為生物實(shí)驗(yàn)中的有力工具。其中，shRNA是可以克隆至表達(dá)載體并表達(dá)siRNA雙鏈的DNA分子。今天給大家分享兩種能快速設(shè)計(jì)shRNA的方法。

 

二、shRNA的設(shè)計(jì):

 

1. Sigma網(wǎng)站

 

Sigma公司做了一個(gè)針對(duì)人和小鼠的shRNA庫，而且部分基因的shRNA序列經(jīng)過驗(yàn)證，因此直接使用Sigma公司已驗(yàn)證過的RNAi序列最為方便。

首先打開網(wǎng)址：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html  出現(xiàn)以下界面：

 

 

以NLRP3基因?yàn)槔�，直接輸入基因名，點(diǎn)擊search，出現(xiàn)以下界面：

 

 

在Products中找到并點(diǎn)擊shRNA選項(xiàng)，出現(xiàn)以下界面：

 

 

點(diǎn)擊“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”這一行的“價(jià)格”，這時(shí)會(huì)彈出界面展示針對(duì)目的基因的shRNA，界面如下：

 

 

 

注：建議選擇CDS區(qū)的shRNA，3UTR基本不選，而且選擇的每一條shRNA盡量在NCBI上做下BLAST，確保靶點(diǎn)的特異性。

 

2. Life Technologies網(wǎng)站

 

Life Technologies公司有個(gè)非常實(shí)用的在線shRNA設(shè)計(jì)軟件，操作非常方便，而且設(shè)計(jì)出來的shRNA不需要再到NCBI上Blast，直接可以使用。

首先打開網(wǎng)址：https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do，在Target Design Options處選中shRNA，以NLRP3基因?yàn)槔�，輸入Accession number或Nucleotide sequence，其他條件不變：

 

 

下拉點(diǎn)擊“RNAi Design”，出現(xiàn)如下頁面：

 

 

選取原則：1.避免選取GGG和CCC等高GC序列 ；2.ShRNA目的序列的第一個(gè)堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè)G。

根據(jù)Rank評(píng)星，從中選取合適靶點(diǎn)序列（一般選擇4條，不同位置各一條），點(diǎn)擊Design shRNA Oligos：

 

 

然后在“Default Loop Sequence”選擇合適的序列，在“Custom Loop Sequence”處輸入合適的loop環(huán)序列，點(diǎn)擊Design，即得shRNA序列。

 

附：維真shRNA序列設(shè)計(jì)如下：