張偉1 賀艷2 劉偉2 吳智淵1 江崢1 許泓2

王勇為1 張?jiān)＞? 鄭文杰*2

 

1(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,上海201206)

2(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,天津300461)

 

摘要 建立了紅葡萄酒酪蛋白過(guò)敏原的質(zhì)譜分析方法。選擇專(zhuān)一性SRM 離子對(duì),建立3 種亞型酪蛋白α-S1, α-S2, β的質(zhì)譜定性與定量方法;利用交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)處理紅葡萄酒有效提取蛋白,并直接快速酶解,使前處理縮短到2 h以?xún)?nèi)。結(jié)果表明,酪蛋白的回收率提高到80%以上,檢出限達(dá)10 μg/ L。

 

關(guān)鍵詞 紅葡萄酒; 酪蛋白; 過(guò)敏原; 前處理; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

 

引起過(guò)敏的物質(zhì)稱(chēng)為過(guò)敏原,一般為蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。隨著食物過(guò)敏患者的增多,以及可能導(dǎo)致過(guò)敏性休克甚至死亡等嚴(yán)重后果,已建立了一系列針對(duì)過(guò)敏原的法規(guī)及檢測(cè)方法,包括核酸法(PCR)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。新興的質(zhì)譜法(MS)靈敏度高、假陽(yáng)性概率低,并具有方法開(kāi)發(fā)快速、運(yùn)行成本低等優(yōu)勢(shì)。

 

葡萄酒釀造過(guò)程中需要加入澄清劑去除沉淀物質(zhì),使酒液獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定性。酪蛋白是常用的澄清劑之一。酪蛋白是一種來(lái)源于牛乳的過(guò)敏原,殘留在葡萄酒中會(huì)對(duì)過(guò)敏人群產(chǎn)生危害。但是葡萄酒,特別是紅葡萄酒含有大量單寧等鞣質(zhì),單寧與蛋白質(zhì)之間存在多點(diǎn)疏水鍵和氫鍵的作用,有很強(qiáng)的蛋白結(jié)合能力。單寧常用作酶抑制劑使酶失活。單寧極大地抑制了葡萄酒蛋白的提取與酶解,傳統(tǒng)蛋白提取方法(超濾、透析、有機(jī)溶劑沉淀等)用于葡萄酒時(shí)回收率只有20% ~30%[1,2] 。因此,關(guān)于葡萄酒過(guò)敏原質(zhì)譜分析的報(bào)道很少,研究對(duì)象也集中在單寧含量很低的白葡萄酒,對(duì)于含有大量單寧的紅葡萄酒的前處理和質(zhì)譜分析仍無(wú)成熟的策略[3,4] 。已報(bào)道的方法如十二烷基硫酸鉀(KDS)法、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)法等,提取后蛋白仍需要電泳去除單寧和兩性電解質(zhì),工作量大,分析通量低,蛋白質(zhì)的回收率很低[5,6] 。

 

交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是PVP 交聯(lián)后形成的顆粒(約110 μm),具有很強(qiáng)的吸附能力[7] 。PVPP 競(jìng)爭(zhēng)性地與單寧結(jié)合,釋放蛋白,可以有效去除單寧等多酚類(lèi)物質(zhì)[8,9] 。本研究利用PVPP 建立了快速、高效的紅葡萄酒蛋白提取與酶解方法,使前處理時(shí)間縮短到2 h 之內(nèi),回收率達(dá)到80% 以上。將本方法與三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/ MS)結(jié)合,分析了紅酒中3 種亞型的酪蛋白,檢出限達(dá)到10 μg/ L,比目前報(bào)道的方法提高了至少一個(gè)數(shù)量級(jí)[3] 。

 

 

TSQ Vantage 三重四極桿質(zhì)譜、Ultimate 3000 超高效液相色譜( Thermo 公司)。α-酪蛋白(α-Casein)、 β-酪蛋白( β-Casein)、胰蛋白酶(Trypsin)、PVPP、NH4HCO3 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司;乙腈、甲酸購(gòu)自Fisher 公司;紅葡萄酒商品若干。

 

樣品制備:取紅酒200 μL 與酪蛋白混合溶液4 μL(α-酪蛋白、 β-酪蛋白各5 μg/ L)充分混勻后(添加量為100 μg/ L 時(shí)),加入200 μL PVPP 混懸液(100 g/ L,溶于0. 5 mol/ L NH4HCO3 溶液),并于30 益振蕩反應(yīng)15 min。反應(yīng)后,直接加入2 μL Trypsin (200 μg/ L),并于37 益振蕩酶解1. 5 h。

 

酶解完成后,于20000 g 離心5 min,取上清液。沉淀加入100 μL 水,振蕩超聲2 min,再于20000 g下離心5 min,將溶液完全取出。兩次溶液合并后,再次20000 g 離心,取上清液直接進(jìn)樣分析。

 

對(duì)照品制備:第一步不加酪蛋白,前處理完成后、進(jìn)樣前,再加入Trypsin 酶解后的酪蛋白混合溶液4 μL(α-酪蛋白、 β-酪蛋白各5 mg/ L ,添加量為100 μg/ L), 混勻后直接進(jìn)樣分析。

 

色譜條件:Hypersil GOLD aQ 色譜柱(100 mm 伊2. 1 mm, 1. 9 μm); 上樣量:10 μL; A 相:0. 1% 甲酸溶液; B 相:0. 1%甲酸-乙腈溶液; 流速:300 μL/ min; 分析梯度:0 ~2 min, 5% B; 2 ~12 min, 5% ~95% B; 12 ~17 min, 95% B, 17 ~18 min, 95% ~5% B; 18 ~23 min, 5% B。

 

質(zhì)譜條件: 掃描模式: SRM,正離子; 噴霧電壓: 3000 V; 氣化溫度: 300 益; 鞘氣壓: 206. 85 kPa;輔助氣壓(Arbitrary units): 10; 離子傳輸管溫度: 350 益; 碰撞氣體(Ar): 0. 20 Pa (1. 5 mTorr); Q1/Q3 分辨率(FWHM): 0. 7; 駐留時(shí)間: 0. 04 s; 離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表1。

 

酪蛋白亞型序列來(lái)自Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù); 專(zhuān)一性肽段與特征性碎片選擇及碰撞能量?jī)?yōu)化由PinPoint軟件(Thermo)分析,結(jié)合LTQ-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜(Thermo) 全掃描確證獲得; 質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Xcalibur Qual Browser 軟件(Thermo)進(jìn)行定性分析,由Xcalibur Quan Browser 軟件(Thermo)進(jìn)行定量分析。

 

 

酪蛋白有α和 β兩種主要亞型,其中α包含S1 和S2 兩種亞型。由于α-S1, α-S2 和 β三者序列完全不同,并同時(shí)具有致敏性,因此同時(shí)針對(duì)這3 種酪蛋白建立LC-MS/ MS 分析方法。根據(jù)Pinpoint 軟件分析,從3 種酪蛋白中分別選擇兩條特征性肽段,每條特征性肽段分別選擇兩個(gè)子離子,即每種亞型對(duì)應(yīng)4 對(duì)離子對(duì),并獲得相應(yīng)的優(yōu)化碰撞能量(表1)。為了確定離子對(duì)選擇的準(zhǔn)確性,進(jìn)一步通過(guò)LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行了數(shù)據(jù)依賴(lài)性?huà)呙璺治?驗(yàn)證了離子對(duì)選擇的合理性(圖1)。

 

表1 酪蛋白特征性肽段及SRM 離子對(duì)選擇

Table 1Unique peptides of casein and design of selective reaction monitoring (SRM) transitions

 

 

 

圖1 αS1-酪蛋白YLGYLEQLLR 肽段MS/ MS 譜圖

Fig. 1 MS/ MS spectrum of peptide YLGYLEQLLR from αS1-Casein

 

圖2 展示了10 mg/ L 酪蛋白酶解產(chǎn)物SRM 掃描的總離子流圖與提取離子流圖。結(jié)果表明,所選擇的肽段保留時(shí)間分布合理、利于區(qū)分; 所選擇的離子對(duì)信號(hào)強(qiáng)度、信噪比良好。需要指出的是,α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為α-S1 與α-S2 的混合物,其中α-S1 約占80%,α-S2 僅占20%。因此,10 mg/ L α-酪蛋白中, α-S1和α-S2 實(shí)際濃度分別為8 和2 mg/ L 。相比PCR 和ELISA 檢測(cè),LC-MS/ MS 不僅能直接對(duì)目標(biāo)過(guò)敏原進(jìn)行鑒定,還可以同時(shí)分析不同亞型,方法的選擇性、準(zhǔn)確度、通量均有很大提高。

 

 

圖2酪蛋白特征性肽段SRM 總離子流圖(TIC)與提取離子流圖(XIC)

Fig. 2 SRM total ion chromatogram and extracted ion chromatogram of casein unique peptides

 

利用PVPP 實(shí)現(xiàn)了紅葡萄酒高效、快速前處理,并最大程度地降低了蛋白的損失。向紅酒中加入足量的PVPP 競(jìng)爭(zhēng)性吸附單寧,再加入過(guò)量的Trypsin快速酶解蛋白,離心取上清液,并重復(fù)一次,合并兩次上清液后直接進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖3)。與傳統(tǒng)方法相比,PVPP 法不僅使回收率明顯提高,也使前處理時(shí)間由12 h(過(guò)夜酶解)縮短到2 h 之內(nèi)。

 

 

圖3PVPP 處理紅葡萄酒的原理與流程

Fig. 3Mechanism and workflow of polyvinylpyrrolidone (PVPP) pre-treatment of red wine

 

PVPP 添加量是影響前處理效率和回收率的關(guān)鍵因素。在酪蛋白添加200 μL 1 mg/ L 的紅酒基質(zhì)中,平行加入不同體積的100 mg/ mL PVPP 混懸液,前處理完成后分別進(jìn)行質(zhì)譜分析,比較總離子流強(qiáng)度(圖4)。結(jié)果表明,在PVPP 混懸液加入量為200 μL,即絕對(duì)量為20 mg 時(shí),響應(yīng)最高,由此確定20 mgPVPP/200 μL 紅酒為最優(yōu)添加量。

 

值得注意的是,PVPP 添加量與處理效果并不完全成正比,當(dāng)超過(guò)最優(yōu)添加量時(shí),質(zhì)譜響應(yīng)反而下降,處理效果變差。這可能與PVPP 的比表面積和吸附力有關(guān):達(dá)到最優(yōu)添加量之前,PVPP 在紅酒中均勻分散成小顆粒,比表面積大、吸附力強(qiáng),有利于酚類(lèi)物質(zhì)吸附;當(dāng)添加量超過(guò)最優(yōu)值后,PVPP 顆粒之間快速團(tuán)聚形成沉淀,吸附能力下降,同時(shí)蛋白也隨酚類(lèi)物質(zhì)摻雜在沉淀中,難以有效釋放。因此,合適的PVPP 添加量對(duì)前處理非常重要。

 

考察了PVPP 法的基質(zhì)效應(yīng),200 μL 紅酒經(jīng)PVPP 處理并添加酪蛋白(1 mg/ L )后質(zhì)譜分析,并與等量經(jīng)PVPP 處理的空白紅酒基質(zhì)進(jìn)行比較。結(jié)果表明(圖5),基質(zhì)對(duì)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)影響不大(峰面積差異小),空白基質(zhì)未見(jiàn)特征肽段的質(zhì)譜響應(yīng)。證明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)無(wú)影響,前處理方法可靠、有效。

 

 

圖4PVPP 添加量對(duì)紅酒中酪蛋白特征肽段SRM 總離子流強(qiáng)度的影響(n =3)

Fig. 4Effect of PVPP addition on total ion chromatogramintensity of casein in red wine (n =3)

 

圖5紅酒基質(zhì)效應(yīng)考察

Fig. 5Effect of red wine matrix on casein analysis

 

紅酒經(jīng)PVPP 處理后,酪蛋白(1 mg/ L , 1 ppm)回收率達(dá)到70%以上(圖6)。而同樣條件下,傳統(tǒng)

方法的回收率很低,丙酮沉淀法回收率為10% ~25%,超濾法回收率低于1%(圖6)。丙酮沉淀法與超濾法是蛋白樣品前處理的經(jīng)典方法,但由于紅酒中存在大量單寧,抑制了蛋白的提取與酶解。PVPP有效解決了這一難題。

 

表2 PVPP 處理0. 1 mg/ L 紅酒酪蛋白的回收率及重現(xiàn)性(n =4)

Table 2Recovery and reproducibility of PVPP method for casein in red wine (n =4)

 

 

在低濃度下,PVPP 法同樣能達(dá)到較高回收率。如表2 所示, 在0. 1 mg/ L 酪蛋白(100 μg/ L)添加量下,特征性肽段的回收率均可達(dá)到75%以上,肽段ALNEINQFYQK 由于響應(yīng)太低,無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算回收率。

 

考察了0. 1 mg/ L 酪蛋白在4 種不同品牌紅酒中的回收率。如表3 所示,特征性肽段的回收率均保持在64% ~ 150% 之間,進(jìn)一步證明了PVPP用于紅酒酪蛋白快速前處理方法高效、可行。

 

表3 不同品牌紅酒經(jīng)PVPP 處理后的回收率考察(n =4)

Table 3Efficiency of PVPP method for casein in different red wines (n =4)

 

為了考察PVPP 法的線(xiàn)性、檢測(cè)限和定量限,添加量為50 mg/ L 的紅酒經(jīng)PVPP 處理后,用空白基質(zhì)稀釋為0. 01 ~50 mg/ L 的12 個(gè)濃度點(diǎn),分別質(zhì)譜分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖7 展示了 β-酪蛋白VLPVPQK肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),在3 ~4 個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi),該肽段具有良好的線(xiàn)性(R2 =0. 9996)和重現(xiàn)性(RSD<6%)。

 

 

圖6紅酒酪蛋白前處理方法的回收率比較:上圖為 β-酪蛋白VLPVPQK 肽段不同處理方法的LC-MS/ MS 色譜峰對(duì)比;下圖為6 條肽段的回收率對(duì)比(n =6)

 

Fig. 6 Recovery comparison of different pre-treatment methods for casein in red wine. Comparison of LC-MS/ MS chromatographic peaks of  β-casein peptide VLPVPQK (up figures); Comparison of recovery of 6 peptides (lower figures) (n =6)

 

 

圖7 紅酒中 β-酪蛋白VLPVPQK 肽段的線(xiàn)性范圍(PVPP法)(n =4)

Fig. 7 Linear response range of peptide VLPVPQK from β-casein in red wine (PVPP method) (n =4)

 

表4 總結(jié)了3 種亞型酪蛋白共6 條肽段的線(xiàn)性范圍,在0. 01 ~50 mg/ L 濃度范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)R2 >0. 99,顯示出良好的線(xiàn)性。

 

表4 PVPP 法的線(xiàn)性范圍與定量限

Table 4Linear response ranges and limits of quantification (LOQs) of PVPP method

 

根據(jù)α-酪蛋白中α-S1 和α-S2 所占比例計(jì)算,最終確定6 條肽段的定量限在10 ~100 μg/ L 之間, 對(duì)應(yīng)到 α-S1,  α-S2 和β-酪蛋白的定量限分別為40, 40 和10 μg/ L(表4),比文獻(xiàn)[3] 報(bào)道方法提高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外,在10 μg/ L 濃度下,所有肽段均有響應(yīng)(信噪比>3), 因此 α-S1,  α-S2, β-酪蛋白的檢測(cè)限均在10 μg/ L 以下,同樣比文獻(xiàn)[3]報(bào)道方法提高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。

 

通過(guò)PVPP 快速前處理,使紅酒中酪蛋白回收率提高到80%以上,使整個(gè)前處理時(shí)間縮短到2 h 之內(nèi),有效解決了紅酒中大量單寧對(duì)蛋白提取與酶解的抑制。將PVPP 法與三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合,分析了紅酒中3 種亞型的酪蛋白 α-S1,  α-S2, β的過(guò)敏原,檢測(cè)限均低至10 μg/ L,定量限達(dá)10 ~40 μg/ L,同時(shí)結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。PVPP 前處理方法簡(jiǎn)單有效、重現(xiàn)性好,適用于高通量的紅葡萄酒過(guò)敏原檢測(cè)。

 

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4 Monaci L, Losito I, Palmisano F, Visconti A. J. AOAC Int. , 2011, 94(4): 1034-1042

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ZHANG Wei1 , HE Yan2 , LIU Wei2 , WU Zhi-Yuan1 , JIANG Zheng1 , XU Hong2 ,

WANG Yong-Wei1 , ZHANG Yu-Jun2 , ZHENG Wen-Jie*2

 

1(ThermoFisher Scientific China, Shanghai 201206, China)

2(Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center, Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin 300461, China)

 

Abstract A MS method for casein allergen analysis was developed to reduce the restriction of protein extraction and digestion from tannins in red wine. Unique selective reaction monitoring (SRM) transitions were selected and confirmed for qualitative and quantitative detection of  α-S1,  α-S2 and β-caseins. Effective extraction and fast digestion of red wine protein were realized by utilizing polyvinylpolypyrrolidone (PVPP),

which also reduced the pre-treatment time within 2 h. Results showed that the PVPP method increased red wine Casein recovery toat least 80%. Simultaneously, the limits of detection decreased to 10 μg/ L, and the limits of quantification to 10-100 μg/ L, which lowered at least one order of magnitude compared to previous reports.

 

Keywords Red wine; Casein; Allergen; Pretreatment; Liquid chromatography tandem mass spectrometry

 

(Received 14 May 2013; accepted 29 June 2013)