玻璃化凍存技術(shù)——成功解決活腫瘤組織凍存復蘇難題，助力活腫瘤樣本庫建設和腫瘤精準治療

玻璃化凍存技術(shù)成功突破了活腫瘤組織凍存復蘇后存活率低的難題，使得凍存的腫瘤細胞可長期保存腫瘤組織活性，組織復蘇后可維持與新鮮腫瘤組織幾乎相同的形態(tài)特征和功能。

1、活腫瘤組織樣本庫的意義

活體組織特別是活腫瘤組織，具有重要的科研和臨床應用價值，活組織保存技術(shù)是實現(xiàn)這些價值的基礎。 常用的活腫瘤組織保存方法主要為建立PDX腫瘤模型保存和凍存。建立PDX腫瘤模型保存，耗時耗力，程序繁瑣，費用昂貴，且經(jīng)過多次傳代后，腫瘤組織容易發(fā)生變異，腫瘤組織異質(zhì)性喪失，失去保存的價值。 

活腫瘤組織凍存即將組織置于低溫環(huán)境中保存，以使組織暫時脫離生長狀態(tài)，保存腫瘤組織的特性。這樣的保存方式省心省力，操作簡便，且成本低廉。在需要的時候才將組織復蘇移植，使之以原代腫瘤形態(tài)增殖，很好地保存了腫瘤的原始突變，可獲得分子、細胞、組織及體內(nèi)等多水平的全面的腫瘤信息數(shù)據(jù)。

2、現(xiàn)有活腫瘤組織凍存技術(shù)——腫瘤組織凍存復蘇后存活率低

以往的新鮮的活腫瘤組織采用的凍存方式與細胞凍存類似，一般為程序降溫凍存，組織凍存液一般由DMSO、血清、細胞培養(yǎng)液組成，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。但是由于血清的成分不定，凍存液的穩(wěn)定性差，使得這種組織凍存液的保質(zhì)期較短，保存條件也較為苛刻。

使用現(xiàn)有的組織凍存液凍存腫瘤組織時，只有極少數(shù)的腫瘤組織可以復蘇或以腫瘤細胞的形式進行傳代，更無法以原代腫瘤的形態(tài)增殖，且極易丟失腫瘤的原始突變，只能獲得分子水平的數(shù)據(jù)信息。故而，現(xiàn)有的組織凍存液的應用范圍狹窄，降低了腫瘤組織樣本的應用價值和科研轉(zhuǎn)化能力。

3、玻璃化凍存技術(shù)——長期保存腫瘤組織活性

最近，我們采用玻璃化技術(shù)成功突破了活腫瘤組織凍存復蘇難題，應用該技術(shù)凍存的腫瘤組織可長期保存腫瘤組織活性，組織復蘇后可維持與新鮮腫瘤組織幾乎相同的形態(tài)特征和功能，該技術(shù)的具體特點是：

• 凍存后可長期保存（>10年）。
• 復蘇后形態(tài)功能與新鮮組織一致。
• 復蘇后仍可分離原代腫瘤細胞。
• 凍存前后PDX成瘤能力基本不變。
• 可替代冰凍切片和石蠟固定組織。
• 實現(xiàn)DNA、RNA和蛋白活性保存。
• 手術(shù)標本、活檢組織均適用。

4、活腫瘤組織樣本庫的應用

腫瘤精準治療的臨床前評價

近兩年來，腫瘤精準治療理念已深入人心，免疫治療和靶向藥物取得一定突破，但目前手術(shù)和放化療仍然是主要治療方式，其中腫瘤化療已成為常規(guī)治療手段。然而，由于腫瘤異質(zhì)性極大，同一種化療方案在不同病人間的治療反應可能迥異，因此如何評價和選擇合適的化療方案，一直是困擾臨床醫(yī)生和病人的主要矛盾。

雖然前期研究人員采用原代腫瘤細胞或組織球在評價腫瘤藥物中取得了一定進展，但這兩種方法均需要對腫瘤組織進行細胞分離，一方面體積較小的腫瘤無法獲得足夠的細胞進行研究，另一方面由于分離的腫瘤細胞脫離了腫瘤組織微環(huán)境，其測試的結(jié)果也往往不能真實反映腫瘤對藥物的敏感性。因此，近幾年在國外對腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)的研究日益受到關(guān)注。研究標明，0.2-0.3毫米的薄層腫瘤組織切片可充分保證其在培養(yǎng)基中對營養(yǎng)的吸收和物質(zhì)交換。在優(yōu)化的培養(yǎng)基和特殊的支持物上，腫瘤組織切片可存活7天以上，完全可滿足體外藥物篩查的要求。與原代腫瘤細胞或組織球相比，薄層腫瘤組織切片需要的組織體積較小，且保留了完整的腫瘤組織結(jié)構(gòu)，通過體外培養(yǎng)結(jié)合化療藥物處理，可真實高效的反映腫瘤對藥物的敏感性。我們的前期研究標明，凍存復蘇的腫瘤組織可保留新鮮組織70-80%的活性，經(jīng)體外腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)測試，與新鮮腫瘤組織切片具有完全相同的藥物反應性，可為腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移患者提供實時的腫瘤藥物敏感性測試。

此外，凍存復蘇的活腫瘤組織還可用于建立PDX模型（人源性腫瘤動物模型），由于高度模擬患者腫瘤的生物特征，PDX模型被認為是最好的腫瘤研究和治療評價模型，用于藥物研發(fā)、測試和生物標志物鑒定。理想的活腫瘤組織應當直接來源于患者，由于PDX模型鼠的建立操作程序復雜繁瑣、運行成本高昂，因此只有少量患者腫瘤組織能被利用。而使用活腫瘤組織凍存技術(shù)，可實現(xiàn)腫瘤組織的即時凍存和隨時復蘇，與PDX模型結(jié)合，可為腫瘤治療的臨床前評價提供體內(nèi)評價模型。因此，活腫瘤組織凍存為腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)和PDX模型建立提供了可能，也為腫瘤精準治療提供了全新的思路。

腫瘤研究的珍貴資源和有效工具

以往的腫瘤組織樣本庫保存的都是“死”的腫瘤組織，如速凍組織和組織蠟塊等，僅能提供DNA、RNA和蛋白等“靜態(tài)”信息，腫瘤一旦凍存即無法“復活”，無法獲得腫瘤的“動態(tài)”信息。由于腫瘤存在極大異質(zhì)性，且腫瘤組織一直處于進化過程中，靜態(tài)和固定化信息不能真實反映腫瘤的變化規(guī)律。另一方面，隨著腫瘤研究的快速發(fā)展，新的治療藥物和手段層出不窮，急需“活“的腫瘤組織進行研究和測試，因此活腫瘤組織凍存和復蘇技術(shù)的突破，為腫瘤研究提供了全新的資源和手段。