量子點（Quantum dot, QD）是一種新型熒光納米材料，又稱半導(dǎo)體納米晶，呈近似球形，三維尺寸在2-10nm，具有明顯的量子效應(yīng)，其物理、光學(xué)、電學(xué)特性優(yōu)于傳統(tǒng)有機熒光染料，是新一代熒光標(biāo)記探針的優(yōu)質(zhì)選擇。

    Chan等將量子點與傳統(tǒng)有機熒光染料進行了光學(xué)特性的比較，發(fā)現(xiàn)量子點的熒光亮度是傳統(tǒng)熒光染料的20倍、量子點的光穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光染料的100倍。但是，量子點作為無機合成的納米材料，其大小、化合價以及細胞內(nèi)遞送等方面也存在一定的局限性。建議研究者根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炘O(shè)計，綜合考慮量子點的光學(xué)特性和物理化學(xué)特性，選擇合適的量子點細胞標(biāo)記方法。本文綜合了量子點在活細胞成像研究中的相關(guān)技術(shù)，以供研究者參考。

一、量子點與傳統(tǒng)熒光染料的比較

1. 熒光亮度：單個量子點比絕大多數(shù)單個有機熒光染料的光亮度強，可多出數(shù)個數(shù)量級（Wu et al, 2003）。

2. 光譜特性：與傳統(tǒng)熒光染料完全不同，量子點的激發(fā)光譜范圍寬泛，在350nm至450nm范圍內(nèi)的紫外光及藍色光源均可激發(fā)量子點發(fā)光；同時，量子點的發(fā)射光譜非常窄，半峰寬小于30nm，而傳統(tǒng)熒光染料的半峰寬達到100nm。量子點上述特性使其適合同一波長的多色激發(fā)、而且多色光之間沒有相互干擾。

3. 光穩(wěn)定性及抗代謝降解能力：量子點的光穩(wěn)定性強于傳統(tǒng)熒光染料，可達數(shù)個數(shù)量級。同時，量子點自身的無機特性，使其具有抗代謝降解的能力，可在機體內(nèi)穩(wěn)定存在數(shù)周至數(shù)月，非常適合對細胞狀態(tài)和分布進行體內(nèi)示蹤。

4. 與生物分子的耦聯(lián)：量子點表面積較大，除了可以耦聯(lián)靶標(biāo)分子（蛋白質(zhì)、多肽、核酸等），還可以耦聯(lián)治療藥物（如抗腫瘤藥物）和檢測試劑（如磁珠、放射性同位素等）。因此，量子點在分子示蹤、活細胞成像、腫瘤診斷與治療以及納米載藥等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

5. 大小：量子點作為呈現(xiàn)殼-核結(jié)構(gòu)的納米材料，其核心的大小一般是3~10nm，其表面需要包被、修飾及水化處理。商品化的量子點一般都大于20nm，該大小的量子點適合在體標(biāo)記組織（如前哨淋巴結(jié)、腫瘤等）或示蹤細胞，但是對于標(biāo)記單個生物分子，則不利于單分子的細胞內(nèi)遷移和軌跡示蹤，需要定制粒徑更小的量子點。

6. 化合價：目前商品化的量子點都是以多價偶聯(lián)方式在其表面結(jié)合多個分子，但是，單分子成像與示蹤需要進行單分子標(biāo)記，目前在量子點表面以單價偶聯(lián)方式進行單分子標(biāo)記尚未商品化、需要專門定制。

7. 細胞內(nèi)遞送：量子點的大小及無機特性使其難于進入細胞，量子點在細胞內(nèi)傾向于聚集，不利于細胞內(nèi)分子成像與示蹤的應(yīng)用。目前，已有相關(guān)輔助試劑或應(yīng)用細胞穿膜肽等技術(shù)，從而提高量子點進入細胞的效率、并保持量子點在細胞內(nèi)的均勻分布。

二、細胞標(biāo)記方法

量子點可以標(biāo)記細胞膜表面分子和細胞內(nèi)分子，其中對細胞膜表面分子的標(biāo)記更為簡單易行。如果研究者的實驗?zāi)康臑槭聚櫦毎�或組織，或是研究細胞表面受體，只需將量子點與膜表面分子進行標(biāo)記；而如果研究者的實驗?zāi)康氖鞘聚櫦毎麅?nèi)的分子，在標(biāo)記之外，尚需考慮量子點標(biāo)記物的細胞內(nèi)遞送方法。關(guān)于細胞標(biāo)記和細胞內(nèi)遞送的方法總結(jié)如下：

1. 細胞表面分子的標(biāo)記

方法一：量子點與膜表面分子的抗體或配體耦聯(lián)

①量子點純化；

②確定靶細胞表面的目標(biāo)分子，以其抗體或配體與量子點耦聯(lián)；

③將上述抗體/配體-量子點偶聯(lián)物，與細胞孵育（建議4℃孵育，以減少細胞對量子點的內(nèi)吞）。

優(yōu)點：細胞標(biāo)記步驟少，只需抗體/配體-量子點耦聯(lián)物與細胞的一步孵育反應(yīng)。

缺點：針對不同的抗體或配體，需要摸索不同的量子點耦聯(lián)方法；同時，某些抗體或配體可能難以進行有效耦聯(lián)。

方法二：通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)實現(xiàn)量子點對膜表面分子的標(biāo)記

①鏈霉親合素-量子點純化；

②確定靶細胞表面的目標(biāo)分子，將其抗體或配體進行生物素化處理；

③將生物素化的抗體或配體，與細胞孵育；

④以培養(yǎng)基或合適的緩沖液清洗細胞，去除過量的生物素化的抗體或配體；

⑤將鏈霉親合素-量子點，與細胞孵育（建議4℃孵育，以減少細胞對量子點的內(nèi)吞）。

優(yōu)點：對抗體或配體進行生物素化處理簡單易行；同時，鏈霉親合素-生物素系統(tǒng)具有信號放大作用。

缺點：細胞標(biāo)記步驟較多，需要兩步孵育反應(yīng)。

2. 細胞內(nèi)分子的標(biāo)記

上述標(biāo)記細胞表面分子的方法，均可用于標(biāo)記細胞內(nèi)分子，即：標(biāo)記形成抗體/配體-量子點偶聯(lián)物或生物素-鏈霉親和素-量子點系統(tǒng)。但是與細胞表面標(biāo)記不同，對于細胞內(nèi)分子的標(biāo)記，尚需考慮量子點偶聯(lián)物的細胞內(nèi)遞送問題，具體遞送方法總結(jié)如下，以供研究者參考。

方法一：細胞直接內(nèi)吞量子點

• 將水溶性量子點與細胞共孵育數(shù)小時；
• 以合適的培養(yǎng)基或緩沖液洗去過量的量子點。

對于不同的細胞，其內(nèi)吞能力不同，需研究者對量子點的用量和孵育時間進行摸索。同時，上述量子點進入細胞后，存在于內(nèi)吞體中。

方法二：通過陽離子脂質(zhì)體遞送量子點入胞

• 制備并純化帶負電荷的量子點（如表面羧基化修飾的量子點）；
• 在無血清培養(yǎng)基中與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine2000或FuGENE6）共孵育（詳細步驟參見轉(zhuǎn)染試劑說明書）。

該方法在腫瘤細胞中適用良好，但是對于不同的細胞、不同的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染能力和效率可能不同，需研究者對試劑用量和孵育時間進行摸索。

方法三：通過胞飲作用遞送量子點入胞

Invitrogen（Life technologies）公司試劑——Influx pinocytic cell-loading reagent（I14402），通過胞飲囊泡的滲透性裂解，將水溶性量子點遞送入活細胞。以該方法進入細胞的量子點，在細胞內(nèi)分布均勻，沒有聚集成團的現(xiàn)象、不形成胞內(nèi)體。該方法周期約30min，可通過重復(fù)加載來增強量子點入胞的量，同時可以再生而重復(fù)利用。該方法不會對細胞造成物理破壞，比顯微注射簡單，同時不會改變細胞活力、不會導(dǎo)致細胞內(nèi)溶酶體酶的釋放。詳細步驟參見試劑說明書。

方法四：通過穿膜肽協(xié)助量子點入胞

細胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPP）又稱PTDs（Protein Transduction Domains），包含大量堿性氨基酸，主要來源于HIV-1的Tat蛋白，其中多聚精氨酸（Polyarginine）較多聚賴氨酸/組氨酸/鳥氨酸等更高效，最高效的是含octa-arginine或nona-arginine（R9）的多肽。CPP的穿膜作用不依賴于其它分子或耗能途徑，幾乎沒有細胞毒性。CPP可將直徑達到200nm的物質(zhì)遞送入細胞，實驗研究顯示，富含精氨酸的CPPs可向細胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)、DNA、RNA以及量子點。

CPPs與量子點的連接方式包括共價偶聯(lián)及非共價偶聯(lián)，而且CPPs可同時遞送共價及非共價偶聯(lián)物進入細胞。量子點與CPPs的共價偶聯(lián)，是基于量子點表面的不同活性基團，利用BS、EDC、sulfo-SMCC、NHS-PEO4-MAL等交聯(lián)試劑形成量子點-CPP偶聯(lián)物；同時，可以通過生物素-親和素系統(tǒng)、靜電相互作用、金屬親和作用等方法，實現(xiàn)量子點與CPPs的非共價偶聯(lián)。總之，針對不同的多肽和實驗需求，需要研究者進行必要的選擇和實驗探索，更詳細的實驗方法請參見相關(guān)文獻。

方法五：顯微注射

玻璃毛細管具有亞微粒級別的尖頭，可將量子點于局部直接注入細胞。該方法中，量子點用量很少（1-10pmol），對細胞的生理特性和發(fā)育沒有明顯影響。

其它方法：

如：刮擦加載量子點入胞，崩潰細胞膜直接將量子點載入細胞漿，電穿孔，低滲休克等，詳見相關(guān)文獻。

如果您想詳細了解量子點活細胞成像的應(yīng)用，可在線預(yù)約講座或?qū)嶒灉贤ǎ?/P>

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