【經(jīng)典的 BMDC 制備方法簡(jiǎn)圖】

                         

DC 是「Dendritic Cells」的縮寫(xiě)，中文全稱為「樹(shù)突狀細(xì)胞」，因其成熟時(shí)伸出許多樹(shù)突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大 籍科學(xué)家 Ralph M.Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的[1],是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen Presenting Cells, APC）。已證實(shí)，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細(xì)胞（Naïve T cells）增殖的APC,而其它種類(lèi)的APC（如單核巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等）僅能刺激已活化的或記憶性的T 細(xì)胞，因此DC是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中也發(fā)揮著極其重要的作用。

雖然DC存在于體內(nèi)多種組織中，但含量很少，無(wú)法滿足科學(xué)研究和臨床治療的需要， 所以人們嘗試多種方法來(lái)體外培養(yǎng)和擴(kuò)增DC。對(duì)于人，最常用的方法是從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）誘導(dǎo)DC的產(chǎn)生。而對(duì)于小鼠，最常見(jiàn)的方法是從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DC,即骨髓來(lái)源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDC）。

鑒于功能分析和分子生物學(xué)研究的需要，獲得更高數(shù)量和更高純度的BMDC是大家一直追求的目標(biāo)，本文將與大家分享BMDC的經(jīng)典制備方法和大量制備法，大家可根據(jù)自身需要選擇使用。

另外，我們還備有實(shí)用的BMDC培養(yǎng)操作視頻（內(nèi)部交流，非商用），因文件比較大，若需要，可通過(guò)我們的企業(yè)QQ（號(hào)碼為：800053055）向我們索取發(fā)送。

【BMDC培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史】

1973年---加拿大籍科學(xué)家Raplph M.Steinman在美國(guó)洛克菲勒大學(xué)（Rockefeller University）工作時(shí)從小鼠外周淋巴器官（脾、淋巴結(jié)和派氏集合淋巴結(jié)）中首次鑒定出樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cells, DC）[1].Steinman 也因此獲得了2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1992年---日本京都大學(xué)（Kyoto University）的Inaba在添加GM-CSF（粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集 落刺激因子）的情況下，分別成功從小鼠血液和骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)出大量的 DC[2,3].因此，Inaba被認(rèn)為是小鼠DC體外培養(yǎng)的創(chuàng)立者，且Inaba法被稱為小鼠BMDC培養(yǎng)的經(jīng)典方法。

1. 這些工作均是在 Ralph M.Steinman的參與下完成的；

2. Inaba培養(yǎng)的BMDC來(lái)源于小鼠股骨和脛骨中的骨髓；

3. Inaba先用抗體+補(bǔ)體法去除骨髓中的淋巴細(xì)胞，以防淋巴細(xì)胞對(duì)BMDC培養(yǎng)的影響；

4. 在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，為防止粒細(xì)胞的干擾，Inaba通過(guò)每2天輕搖培養(yǎng)板并3/4體積換液的方法來(lái)盡量去除粒細(xì)胞；

5. Inaba證實(shí)單用GM‐CSF通過(guò)6‐8天的培養(yǎng)，即可從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)得到 大量的 DC 細(xì)胞，而且混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)提示其為成熟的 DC 細(xì)胞；

6. 該法可從一個(gè)小鼠的骨髓中培養(yǎng)獲得5‐7 x 106個(gè)DC細(xì)胞。

1994年---奧地利因斯布魯克大學(xué)（University of Innsbruck）的Romani等發(fā)現(xiàn)GM-CSF和IL-4（白細(xì)胞介素 4）聯(lián)合誘導(dǎo)，可從人血液 PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）制備出大量的DC,而GM-CSF單獨(dú)誘導(dǎo)的效果不好[4].后來(lái)，科學(xué)家也將IL-4應(yīng)用于小鼠BMDC的培養(yǎng)[5,6].

1999年----德國(guó)明斯特大學(xué)（University of Munster）的Labeur研究表明，單獨(dú)用GM-CSF誘導(dǎo)的BMDC為未成熟DC（immature DC, iDC），GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)出來(lái)的BMDC的成熟度居中，添加CD40L或LPS可進(jìn)一步誘導(dǎo)DC完全成熟，即成熟 DC（mature DC, mDC）[7].

1999年---德國(guó)埃爾朗根大學(xué)（University of Erlangen）的Lutz開(kāi)發(fā)出一種可獲得超大量BMDC的方法，每只小鼠可獲得的BMDC的數(shù)量Inaba 經(jīng)典方法的50倍之多，達(dá)1-3 x108個(gè)DC細(xì)胞/小鼠[8].該法被DC研究者廣泛認(rèn)可和使用。

1. 骨髓不作任何預(yù)先處理；

2. 使用細(xì)菌培養(yǎng)皿（Petri Dish）替代細(xì)胞培養(yǎng)板；

3. 細(xì)胞的初始鋪板密度低，為 2 x 105/ml;

4. 培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至10‐12天；

5.仍僅用GM‐CSF誘導(dǎo)，但第8天或第10天后減量使用；

6.第6天和第8天半量換液，但吸出的懸浮細(xì)胞離心后放回原板。

    2002年---美國(guó)匹茲堡癌癥研究院大學(xué)（University of Pittsburgh Cancer Institute（UPCI））的Son也研發(fā)出一種超大量BMDC培養(yǎng)方法，稱為 bulk-culture method.該法每只小鼠可獲得的BMDC的數(shù)量是Inaba經(jīng)典方法的7-10倍，即3 – 4 x 107個(gè)BMDC，而且培養(yǎng)時(shí)間與Inaba經(jīng)典方法相似，僅需7天[9].

1. 骨髓取出后僅溶血，不做任何其它處理；

2. 使用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)；

3. 培養(yǎng)過(guò)程中使用GM‐CSF+IL‐4聯(lián)合誘導(dǎo)；

4. 培養(yǎng)的第4天和第7天補(bǔ)加足量的GM‐CSF和IL‐4；

                           

摘自文獻(xiàn) Son YI, et al. J Immunol Metods. 2002; 262（1-2）： 145-57 [9]

【經(jīng)典的BMDC培養(yǎng)法】-Inaba法（改良）[3,10]

¾ 背景：

1.  Inaba法獲得的BMDC數(shù)目為5-7 x 106個(gè)/小鼠；

2.  Inaba原法操作比較復(fù)雜，需要將骨髓中的淋巴細(xì)胞等用抗體+補(bǔ)體法預(yù)先去除， 后來(lái)的改良法均省卻了這個(gè)步驟，其實(shí)Inaba后來(lái)自己也說(shuō)這個(gè)步驟雖然可提高BMDC的純度，但不會(huì)對(duì)BMDC的生成產(chǎn)生影響，可做可不做 [10]；

3.  Inaba原法僅用GM-CSF來(lái)誘導(dǎo)BMDC的產(chǎn)生，雖然得到的BMDC在混合淋巴 細(xì)胞反應(yīng)中有較強(qiáng)的刺激能力，但DC的成熟度不及GM+IL-4的聯(lián)合誘導(dǎo)，所以后來(lái)的改良法中多用GM+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)。

¾ 培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細(xì)胞的獲得

1.1  小鼠（6-10周齡）頸椎脫臼法處死，手術(shù)取出所有股骨（femurs）和脛骨（tibias），并剪刀和鑷子將骨周?chē)�的肌肉組織盡量去除干凈；注：不要損傷到骨。

1.2  將骨移至超凈臺(tái)內(nèi)，并用盛有70%酒精的無(wú)菌培養(yǎng)皿浸泡2-5 min，以消毒滅 菌，然后用無(wú)菌的PBS洗2次；

1.3  將骨移入另一個(gè)盛有PBS的新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨完全變白；

1.4  收集骨髓懸液，用200目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織；

1.5  濾過(guò)液1200rpm離心5 min，棄上清；

1.6  加入2 ml氯化銨紅細(xì)胞裂解液（1x），重懸細(xì)胞，室溫孵育 3-5 min,最長(zhǎng) 10min；氯化銨紅細(xì)胞裂解液的配制：

注：1）先配制10x 的貯存液，配法如下：稱取 82.9 g NH4Cl,10.0 gKHCO3 和 0.37 g Na2EDTA,溶于1L的蒸餾 水中，0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌，4oC儲(chǔ)存6個(gè)月；注：可根據(jù)需要配制適量的10x 貯存液，其中各組分需成比例增減。

注：2）臨用前，將10x 貯存液用無(wú)菌蒸餾水1:9稀釋成1x 工作液即可。因氯化銨紅細(xì)胞裂解液對(duì)骨髓細(xì)胞有一定的傷害作用，所以要盡量縮短溶血時(shí)間。

1.7  加入10ml PBS中和裂解液的作用，然后1200 rpm離心5 min,棄上清；

1.8  PBS洗1次，然后用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，至此已獲得小鼠骨髓細(xì)胞。

2. BMDC的誘導(dǎo)分化

2.1  步驟1中獲得的小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5-1x106/ml;

2.2  鋪至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml細(xì)胞，同時(shí)加入重組小鼠 GM-CSF（20 ng/ml）和IL-4（10 ng/ml），37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，此為培養(yǎng)的第0天；

注：1）  一般一只小鼠大約可收獲4-5 x 107個(gè)骨髓細(xì)胞，所以可以鋪至少40-50個(gè)24孔板板孔。

    2）   GM-CSF和IL-4的使用濃度區(qū)間分別為20-50 ng/ml和10-40 ng/ml。

2.3  每2天輕輕搖晃培養(yǎng)板，然后3/4體積更換新鮮培養(yǎng)液，并補(bǔ)足細(xì)胞因子。

注：1）  此步驟的目的是去除粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，因粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為懸浮生 長(zhǎng)；

    2）  Inaba 認(rèn)為培養(yǎng)的前4天，大部分DC貼壁仍較牢，所以此法不會(huì)大量損失 DC；

    3）  若發(fā)現(xiàn)損失的DC細(xì)胞過(guò)多，可僅在培養(yǎng)的第2天用此法換液；

    4）  在培養(yǎng)的第4天，可以看到聚團(tuán)生長(zhǎng)的DC貼附于板底，第6天則可觀察到很多DC成集落生長(zhǎng)。

2.4  在第5天和第8天之間，輕柔吹打培養(yǎng)液，收集懸浮細(xì)胞及巰松貼壁生長(zhǎng)的細(xì) 胞；

注：1） 最佳收集時(shí)間是培養(yǎng)的第6天；

    2） 此時(shí)的細(xì)胞已經(jīng)是BMDC,但成熟度不高，所以需要后續(xù)的再鋪板（subculture）步驟使其更成熟；

    3） 吸出培養(yǎng)液（含DC細(xì)胞）的24孔培養(yǎng)板需補(bǔ)充新鮮的含重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10 ng/ml）的 RPMI 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)， 以便后面能夠再次收集BMDC。

2.5  1200 rpm離心5 min，棄上清；

2.6  用含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后調(diào)整細(xì)胞濃度 至1 x 106/ml,并加入重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）；

2.7  細(xì)胞鋪板至100 mm培養(yǎng)皿（每皿最多10ml）或6孔培養(yǎng)板（2m/孔）。

2.8  37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2天；

2.9  收集懸浮細(xì)胞，即為較成熟的BMDC。

注：1） 第2.5-2.8步為再鋪板（subculture）步驟，目的是使第2.4步獲得的BMDC更加成熟。

    2） 再鋪板后的3 h內(nèi)可見(jiàn)許多棘狀貼壁細(xì)胞從DC簇中遷移出來(lái)，而培養(yǎng)1天后會(huì)發(fā)現(xiàn)這些貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)板底脫離，而且可以看見(jiàn)在培養(yǎng)液中漂浮著許多典型的DC.

3. BMDC的完全成熟

注：步驟2中獲得的BMDC并非完全成熟的DC,若想得到完成成熟的DC,還需LPS,CD40L或TNF-a等的誘導(dǎo)。

3.1 步驟2.4或2.9中獲得的BMDC以1200rpm離心5 min,棄上清；

3.2 用含重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的RPMI完全培養(yǎng)液重懸沉淀，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1x106/ml；

3.3 加入24孔培養(yǎng)板中，并加入成熟誘導(dǎo)劑，如TNF-α（250U/ml），LPS（1μg/ml）、或 CD40L（1μg/ml）等；3.437℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天；

3.5 收集懸浮細(xì)胞及疏松貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞即為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。

【BMDC大量制備法】-Son法[9]

背景：

1.  該法可在7天內(nèi)獲得30-40x106個(gè)DC/小鼠，是Inaba 經(jīng)典方法的7-10 倍。DC經(jīng)14.5%甲泛葡胺（Metrizamide）梯度離心后，純
    度（即 CD11c+/I-Ab+ 細(xì)胞）可達(dá)85-95%.

2.  該法獲得的DC的內(nèi)吞能力弱于Inaba 經(jīng)典方法，但分泌的IL-12p70量相似；

3.  該法獲得的DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中比Inaba經(jīng)典方法呈現(xiàn)更強(qiáng)的刺激能力；

4.  該法獲得的DC能引起更強(qiáng)的特異性T細(xì)胞反應(yīng)；

5.  以上結(jié)果提示，該法比經(jīng)典方法能獲得更多、更成熟的BMDC。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細(xì)胞的獲得

見(jiàn)Inaba法（改良）中的相應(yīng)步驟。

2. BMDC 的大量制備

2.1  步驟1中獲得的小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含 10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2 x 105/ml;

2.2  鋪至6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔5 ml 細(xì)胞，同時(shí)加入重組小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和IL-4（1000 U/ml），37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

注：1）作者試探了125 U/ml、250 U/ml、500 U/ml 和 1000U/ml四個(gè)細(xì)胞因子濃度，發(fā)現(xiàn)濃度越低，BMDC細(xì)胞產(chǎn)量和成熟度越低，所以仍建議用1000 U/ml。

    2）  筆者認(rèn)為，1000 U/ml 是一個(gè)非常高的濃度，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)成本過(guò)高。

2.3  在培養(yǎng)的第4天，向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充重組小鼠 GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml）； 注：向培養(yǎng)體系中直接補(bǔ)充細(xì)胞因子而不換液的目的是避免出現(xiàn)任何細(xì)胞損失，以獲得最大量的DC.筆者認(rèn)為，培養(yǎng)過(guò)程中必然會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液發(fā)黃 的情況，如果不換液而只是添加細(xì)胞因子，細(xì)胞很快會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不夠而死亡。所以筆者建議在第4天和第7天時(shí)將培養(yǎng)液半量或3/4量吸出，離心后加入含足量GM-CSF和IL-4的新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，然后再將 細(xì)胞放回至原板。

2.4  培養(yǎng)的第7天收集 DC，用2-4ml RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，加至等體積的14.5%（w/v）甲泛葡胺上，1200 x g室溫離心20 min。
     注：此時(shí)的DC為不完全成熟的BMDC,要想進(jìn)一步成熟，請(qǐng)?zhí)�至步驟 3。

2.5  收集中間層，并用RPMI 1640完全培養(yǎng)液洗3次備用。

3. BMDC 的完全成熟

3.1  步驟2.4中收集的 BMDC,重新鋪板，并向培養(yǎng)體系中加入重組小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml），以及 LPS（1-10μg/ml）
3.2  37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2 天，獲得成熟的BMDC。

【BMDC大量制備法】-Lutz法[8]

¾ 背景：

1. Lutz法與Son法相似，均可大量制備BMDC，但與Son 法相比，Lutz法更為廣泛地被采用，從以下兩個(gè)方面可以得到印證：

1） 雖然Lutz法比Son法早發(fā)表3年（分別是1999年和2002年），但截至2015年12月，PubMed中已有633篇文獻(xiàn)中引用Lutz法，而僅有24篇文獻(xiàn)引用 Son法。

2） 在美國(guó)著名的學(xué)術(shù)社交平臺(tái)：www.researchgate.net 上有一個(gè)交流帖，問(wèn)：Does anyone have a protocol for generating dendritic cells from mouse bone marrow using GM-CSF? 回答者中大多數(shù)推薦和盛贊Lutz的BMDC培養(yǎng)法。

2.  該法可獲得更多的 BMDC,達(dá)1-3 x 108 個(gè)/小鼠，而且純度可達(dá) 90-95%；

3.  該法比Son法使用的細(xì)胞因子濃度低得多，僅為200 U/ml，而且培養(yǎng)的第8天到 第10天降為30-100 U/ml，這樣可以大幅節(jié)約試劑成本；

4. 該法與Inaba經(jīng)典方法和Son法的最大不同是使用細(xì)菌培養(yǎng)皿（Petri dish）而非細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)培養(yǎng)骨髓細(xì)胞。Inaba的解釋是細(xì)菌培養(yǎng)皿不容易使骨髓中的巨噬 細(xì)胞貼壁，從而抑制巨噬細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而避免巨噬細(xì)胞對(duì)DC成熟的抑制作用， 這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量 BMDC 的主要原因。

5. 但該法的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，需要10-12天，一方面是為了獲得更多的BMDC，另一 方面，大多數(shù)粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞很難存活這么長(zhǎng)時(shí)間，因此可提高最終獲得的BMDC的純度；

6. 該法僅用GM-CSF進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若 要進(jìn)一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再誘導(dǎo)1-2 天，其中成熟DC細(xì)胞的含量將達(dá)到50-70%。

¾ 培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細(xì)胞的獲得

見(jiàn)Inaba法（改良）中的相應(yīng)步驟，注意省去溶血步驟。

2. BMDC 的大量制備

2.1  步驟1中獲得的小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含 10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 x 105/ml;

2.2  鋪至100 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿（Petri Dish） 中，每皿10 ml細(xì)胞，同時(shí)加入重組小鼠GM-CSF（200 U/ml,對(duì)于PeproTech的GM-CSF,相當(dāng)于20 ng/ml），37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；注：此處使用的是細(xì)菌培養(yǎng)皿，而非細(xì)胞培養(yǎng)板。

2.3  第3天時(shí)，向培養(yǎng)皿中再加入10 ml含20 ng/ml重組小鼠GM-CSF的完全培養(yǎng)液；

2.4  第6天和第8天分別半量換液，即收集舊培養(yǎng)液，離心后用含20 ng/ml重組小鼠GM-CSF的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，然后再將細(xì)胞懸液放回原皿；

2.5  第10天時(shí)可收集細(xì)胞，即為BMDC。

注：1）此時(shí)也可繼續(xù)培養(yǎng)至第12天。若繼續(xù)培養(yǎng)，可使用30-100 U/ml（即3 ng-10 ng/ml）的重組小鼠GM-CSF.

    2）雖然培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞表型上越成熟（CD11c的表達(dá)量高），但混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)第8天和第10天收獲的BMDC具有最強(qiáng)的刺激能力，而培養(yǎng)第12天的BMDC刺激能力明顯減弱。

    3）經(jīng)過(guò)10天的培養(yǎng)，每皿平均可收獲9.2 x 106個(gè)細(xì)胞。

3. BMDC的完全成熟

3.1  培養(yǎng)第10天的DC用移液器輕輕吹打收集懸浮細(xì)胞，300 x g室溫離心5 min；

3.2  棄上清，用10 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，然后鋪于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)板；注：此處不再用細(xì)菌培養(yǎng)皿，而是用細(xì)胞培養(yǎng)板，因      BMDC已形成，呈半懸浮狀態(tài)，骨髓中殘留的巨噬細(xì)胞前體雖然可貼附于細(xì)胞培養(yǎng)板，但不再會(huì)對(duì)DC的成熟起到抑制作用，反而會(huì)因?yàn)槠滟N于板底而使懸液中的DC的純度更高。

3.3  加入重組小鼠GM-CSF（100 U/ml , 相當(dāng)于PeproTech的10 ng/ml）和TNF-α（500 U/ml），或重組小鼠GM-CSF（100U/ml,相當(dāng)于PeproTech 的10ng/ml）和LPS（1 μg/ml）；

3.4  37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2天。

【BMDC的鑒定】

1. 形態(tài)學(xué)觀察：BMDC 多數(shù)呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞有多個(gè)樹(shù)突樣突起，成熟的 BMDC 更加 明顯；

2. 細(xì)胞表型分析：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC細(xì)胞表面 CD11c,CD40,CD80,CD86,MHC II類(lèi)分子（I-A/I-E） 等的表達(dá)，BMDC高表達(dá)這些分子，完全成熟的BMDC中這些分子的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步提高。

3.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）：BMDC具有較強(qiáng)的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越強(qiáng)。

摘自文獻(xiàn) Lutz MB, et al. J Immunol Metods. 1999; 223（1）： 77-92 [8]

                           

【注意事項(xiàng)】

1.  小鼠品系和性別：

    多數(shù)研究表明，所使用的小鼠品系與獲得 BMDC 的數(shù)量和成熟度關(guān)系不大[9]，但也有研究表明C57BL/6小鼠可能更好。

    Lutz表示從C57BL/10,DBA/2,C3 H/J和129等小鼠品系均可獲得足夠數(shù)量和純 度的 BMDC,但 Lutz 在其實(shí)驗(yàn)中更傾向于使用 C57BL/6,ICR 和 BALB/c小鼠，且發(fā)現(xiàn) C57BL/6 小鼠的BMDC產(chǎn)量最高，而且ICR小鼠和C57BL/6小鼠的BMDC對(duì)LPS 的成熟誘導(dǎo)敏感度高于BALB/c小鼠[8].

    關(guān)于小鼠的性別，Inaba認(rèn)為雄性小鼠更好些，因?yàn)樗麄兊墓趋栏�大，從而可以獲 得更多的前體細(xì)胞[10],但多數(shù)學(xué)者更傾向于使用雌性小鼠。

    因此，目前培養(yǎng)BMDC用的比較多的小鼠是雌性或雄性C57BL/6小鼠。

2.  單獨(dú)使用GM-CSF還是聯(lián)合使用IL-4?

    Inaba經(jīng)典法和Lutz大量制備法中均僅用GM-CSF即可誘導(dǎo)出相當(dāng)數(shù)量的 BMDC,而且也在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的刺激作用，但其實(shí)這些 BMDC的成熟度并不足夠高。

    研究顯示，GM-CSF+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)比GM-CSF單獨(dú)誘導(dǎo)產(chǎn)生的BMDC表達(dá)更高的MHC II類(lèi)分子和共刺激分子CD80和CD86等，提示前者具有更強(qiáng)的抗原遞呈能力，而且前者在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中表現(xiàn)出更有效的刺激能力[5,7].在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)的BMDC可產(chǎn)生保護(hù)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，而GM-CSF單獨(dú)誘導(dǎo)的BMDC的保護(hù)性較弱 [6],這些都說(shuō)明 GM-CSF+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)的BMDC的成熟度高于GM-CSF單獨(dú)誘導(dǎo)的BMDC.

    德國(guó)明斯特大學(xué)（University of Munster）的Labeur研究也表明，單獨(dú)用GM-CSF誘導(dǎo)的BMDC為未成熟DC,GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的BMDC 的成熟度居中，添加CD40L或LPS可進(jìn)一步誘導(dǎo)BMDC完全成熟 [7].

因此筆者認(rèn)為，要想獲得功能更好的BMDC,最好用GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞。而且，如果能在Inaba經(jīng)典法和Lutz大量制備法中添加IL-4,應(yīng)該會(huì)獲得更加成熟、有效的BMDC.

3.  成熟誘導(dǎo)劑的選擇

    LPS，CD40L和TNF-α無(wú)論對(duì)人DC還是小鼠DC均是常用、有效的成熟誘導(dǎo)劑，那么應(yīng)該選擇哪個(gè)呢？

    TNF-a 誘導(dǎo)DC的成熟能力在三者中最弱[7,8].LPS 和 CD40L均是DC體外完全成熟的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，兩者誘導(dǎo)DC的成熟度相似，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子譜有差異。CD40L誘導(dǎo)成熟的BMDC在體內(nèi)顯示出最強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，包括保護(hù)性和治療性腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生[7].

    用LPS刺激DC完全成熟所用的濃度一般為 1-10μg/ml，但其實(shí)0.1 μg/ml已經(jīng)有非 常強(qiáng)的作用，但保險(xiǎn)起見(jiàn)，一般選用1 μg/ml。

    對(duì)于CD40L需要注意的是，CD40L分子屬于TNF配體家族，該家族的特點(diǎn)是在形 成三聚體后才能發(fā)揮作用。所以最好能用重組的CD40L三聚體蛋白來(lái)刺激DC,這樣會(huì)有很好的效果。如果用CD40L單體來(lái)刺激DC,多數(shù)情況下成熟度并不是很高。

4.  培養(yǎng)方法的選擇

    本文列出迄今為止最常用的三種BMDC培養(yǎng)方法，我們從下表中可以更清楚地看出這三種方法的異同，相信您能根據(jù)您的需要作出正確的判斷。

                         

注：1. 該表是從文獻(xiàn)[8]修改和添加而來(lái)；

    2. 這里的Inaba法指的是其原法[2],而不是本文中的改良法。

【BMDC 培養(yǎng)試劑推薦】
 

【BMDC 鑒定試劑推薦】
 

    注：用于DC鑒定的表面標(biāo)志物的表達(dá)在流式圖上均呈現(xiàn)單個(gè)峰，且多數(shù)情況下不能與陰性峰完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。為避免多色分析時(shí)補(bǔ)償調(diào)節(jié)不好導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性，建議最好用單標(biāo)，最多用雙標(biāo)來(lái)做DC表面標(biāo)志的分析，而且必須使用同型對(duì)照，而非空白細(xì)胞對(duì)照來(lái) 排除背景染色。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 1973; 137 （5）： 1142–62.

[2] Inaba K, Steinman RM, et. al. Identification of proliferating dendritic cell precursors in mouse blood. J. Exp. Med. 1992; 175（5）：1157-67.

[3] Inaba K, Inaba M, et. al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176（6）：1693-702.

[4] Romani N, Gruner S, et. al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J. Exp.

Med. 1994; 180（1）：83-93.

[5] Zorina T, Mayordomo JI, et. al. Culture of dendritic cells from murine bone marrow supplemented with GM-CSF and TNF-alpha J. Immunother. 1994; 16（3）：247.

[6] Mayordomo JI, Zorina T, et. al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1995;1（12）：1297-302.

[7]  Labeur MS,  Roters B,  et. al. Generation of  tumor immunity by  bone  marrow-derived dendritic  cells  correlates  with  dendritic  cell  maturation  stage.  J   Immunol.  1999;162（1）：168-75.

[8] Lutz MB, Kukutsch N, et. al. An advanced culture method for generating large quantities of highly  pure  dendritic  cells  from  mouse  bone  marrow.  J  Immunol  Methods.  1999;223（1）：77-92.

[9] Son YI, Egawa S, et. al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. J Immunol Methods. 2002; 262（1-2）：145-57.

[10] Inaba, K., Romani, N., et al. Generation of dendritic cells from proliferating mouse bone marrow progenitors. In: Coico, R., Ranz, A., Kruisbeek,A.M. （Eds.）， Current Protocols in Immunology.Wiley, New York. 1998; Unit 3.7.