TUNEL 法測凋亡操作步驟       
一、TUNEL檢測原理
      TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是采用非同位素方法來檢測細(xì)胞在凋亡過程中DNA 的斷裂情況，可在原位快速準(zhǔn)確地檢測單個凋亡細(xì)胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）的凋亡原位檢測。
     其原理是細(xì)胞凋亡發(fā)生時，內(nèi)源性核酸酶激活，使DNA的雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）作用下，組織細(xì)胞原位DNA切口可被標(biāo)記上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling），可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，顯示為棕色（過氧化物酶活性），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細(xì)胞；由于正的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH 形成，很少能夠被染色。
二、試劑盒組份
       組   份                                           10 assays             25 assays               儲存條件
A：Equilibration Buffer                           1.0 mL                  2.5 mL                    -20 ℃          
B：Biotinylated Nucleotide Mix               10 μL                    25 μL                     -20 ℃
C：TdT Enzyme                                    10 μL                    25 μL                     -20 ℃          
D：500×Proteinase K                           10 μL                    25 μL                     -20 ℃
       20×SSC                                       15 mL                   38 mL                     4 ℃
E：Streptavidin-HRP                              10 μL                   25 μL                       4 ℃
F：20×DAB Substrate Buffer                 50 μL                  125 μL                      4 ℃           
G：20×DAB Chromogen                       50 μL                  125 μL                      4 ℃
H：20×Hydrogen Peroxide                    50 μL                  125 μL                      4 ℃
三、操作流程
1.操作流程概覽
 
2.細(xì)胞樣本制備
準(zhǔn)備：
    ● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去離子水中，HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1L。
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
    ● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇；
    ● 細(xì)胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；
操作步驟：
1)經(jīng)過實驗處理的細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片，自然晾干；
2)室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；
4)浸入細(xì)胞膜通透液中，室溫30sec~2min；
5)進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。
3.石蠟包埋組織切片預(yù)處理
準(zhǔn)備：
    ● 石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；
    ● 蛋白酶K工作液：2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS；
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
    ● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇。
操作步驟：
1)石蠟包埋的組織切片按常規(guī)方法脫蠟至水；
2)PBS漂洗3×5min；
3)加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)15~30min；PBS漂洗3×5min；
4)（選擇進(jìn)行）室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
5)浸入封閉液中，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min；
6)進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。
4.冰凍組織切片預(yù)處理
準(zhǔn)備：
    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
    ● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇；
    ● 細(xì)胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；
操作步驟：
1)冰凍切片浸入固定液，室溫固定10min；PBS漂洗3×5min；
2)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入通透液中，室溫30sec~2min；
4)進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。
5.陽性對照和陰性對照的準(zhǔn)備
TUNEL檢測時需要設(shè)立陽性對照和陰性對照，以顯示實驗的客觀性和準(zhǔn)確性。
1)陽性對照樣本的處理（選擇進(jìn)行）
   DNaseI反應(yīng)液（用戶自備）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9； 
                                                   10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）
組織樣本經(jīng)過蛋白酶K處理或者通透液處理，PBS浸洗后，加入100 μL DNaseI反應(yīng)液，室溫孵育10~30min，用去離子水徹底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。
2)陰性對照樣本的處理
   在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)過程配制TdT酶反應(yīng)液時，不加入TdT酶，其余步驟相同。
四、標(biāo)記和顯色反應(yīng)
以下操作在濕盒內(nèi)進(jìn)行。
1.預(yù)處理好的樣本經(jīng)過PBS漂洗后，用濾紙輕輕吸去樣本周圍液體；
2.每個樣本滴加100 μL TdT酶反應(yīng)液，于37＆#61616;C避光反應(yīng)60min；
TdT酶反應(yīng)液的準(zhǔn)備（即用即配）：
  成分                                        標(biāo)準(zhǔn)100 μL/片        切片數(shù)        總體積
  Equilibration Buffer                    98 μL                     ×                =
  Biotinylated Nucleotide Mix        1 μL                      ×                =
  TdT Enzyme                             1 μL                      ×                =
陰性對照片不加TdT酶。
3.用去離子水按1：10稀釋20×SSC，進(jìn)行終止反應(yīng)，室溫15min；然后PBS漂洗3×5min；
4.浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；
5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀釋為工作液），于37℃反應(yīng)30~60min；
6.PBS漂洗3×5min；
7.滴加DAB顯色液：
  成分                                         100 μL/片       切片數(shù)     總體積
  20×DAB Substrate Buffer             5                   ×             =
  20×DAB Chromogen                    5                   ×            =
  20×Hydrogen Peroxide                 5                  ×            =
  ddH2O                                        85                  ×            =
8.用去離子水漂洗數(shù)次；（選擇進(jìn)行復(fù)染細(xì)胞核）；
9.中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。
注意事項：
1.PBS清洗后，請盡量去除PBS液體再進(jìn)行下一步反應(yīng)；
2.避免載波片上的樣本干燥造成實驗失��；
3.TdT酶反應(yīng)液應(yīng)即用即配，在冰上進(jìn)行，不宜長期保存；
4.復(fù)染細(xì)胞核可以用甲基綠染液（用戶自備）。
 
參照圖