基因工程，黃金對(duì)比：六大病毒載體技術(shù)的比較；不同基因傳遞方法的比較
銳賽生物-GeneDelivery
病毒載體
經(jīng)典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細(xì)胞譜廣，效率高等特點(diǎn)并廣為研究人員熟知。它們的特點(diǎn)總結(jié)歸納如表一。
表一：六大病毒載體技術(shù)的比較
病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞的優(yōu)勢
通過表二，可以發(fā)現(xiàn)病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)方法相比非病毒載體，具備高效，廣譜，長期穩(wěn)定表達(dá)以及能用于動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞等幾乎所有優(yōu)點(diǎn)。
表二：不同基因傳遞方法的比較
病毒制備和感染：
腺病毒：
腺病毒基因組非常大，而且酶切位點(diǎn)非常少，導(dǎo)致很難直接制備腺病毒載體。通常通過使用穿梭載體在細(xì)菌或者包裝細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行重組從而將外源片段轉(zhuǎn)移到病毒基因組中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒載體后，其兩側(cè)為長片段重復(fù)序列(LTR)以及
腺相關(guān)病毒：
腺相關(guān)病毒載體含有反向末端重復(fù)序列(ITR)。輔助質(zhì)粒用來表達(dá)病毒包裝必須基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事項(xiàng)：
插入片段大小和插入片段性質(zhì)因素：一些插入片段的表達(dá)由于對(duì)宿主或者包裝細(xì)胞系有毒性從而使得滴度比較低。在這種情況下，使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。還有一些插入片段太大或者太小都可能導(dǎo)致病毒包裝效率不高。 添加輔助序列增加插入片段的大小或者對(duì)病毒進(jìn)行濃縮純化提高滴度。插入片段如果過大可以選擇容量更大的病毒包裝系統(tǒng)。
小竅門：
構(gòu)建分子病毒載體時(shí)，使用recA-細(xì)菌擴(kuò)增病毒分子載體。當(dāng)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞時(shí)，盡可能使用傳代次數(shù)低的細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
使用純度盡可能高的質(zhì)粒，最理想的是經(jīng)過氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒。收獲病毒后，推薦進(jìn)行病毒濃縮并使用病毒純化試劑盒或者氯化銫密度梯度離心純化。
小竅門：
用病毒去感染細(xì)胞時(shí)，加入polybrene會(huì)增加感染效率
小竅門：
將病毒凍存在-80°C。但盡量減少凍融次數(shù)，推薦分裝成單次使用量的小容量包裝。避免反復(fù)凍融3次以上。
表三：化學(xué)，物理和病毒載體方法進(jìn)行基因傳遞的具體優(yōu)缺點(diǎn)比較
基因傳遞方法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)
病毒載體 • 高感染效率，廣譜性高 • 制備復(fù)雜
• 適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)操作 • 對(duì)病毒載體質(zhì)量要求高
• 能高效感染體內(nèi)細(xì)胞 • 需要低溫(-80°C )儲(chǔ)存
• 可以在體內(nèi)感染特定細(xì)胞 • 價(jià)格偏高
• 易篩選細(xì)胞穩(wěn)定株 • 部分病毒載體對(duì)基因大小有容量限制
化學(xué)方法 • 部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高 • 廣譜性不高
• 易操作 • 部分試劑毒性大
• 對(duì)轉(zhuǎn)染基因大小容量限制小 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果差
• 試劑穩(wěn)定，易儲(chǔ)存
物理方法 • 對(duì)大部分體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高 • 需要購買昂貴設(shè)備
• 易操作 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果差
為什么是shRNA？
外源導(dǎo)入的siRNA結(jié)合RISC復(fù)合物的能力要比shRNA低10倍，雖然將siRNA的長度增加到29-30 nt可以增加結(jié)合RISC復(fù)合物的效率，但也增加了off target效應(yīng)，引起更多的非專一性基因干擾。shRNA由于模擬microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的優(yōu)缺點(diǎn)見表四。銳賽選擇使用病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾，并通過構(gòu)建shRNA穩(wěn)定株，能最大程度的避免使用體外化學(xué)合成的siRNA所帶來的一系列問題。
a: 1) 改善off target效應(yīng); 2) 提高細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性
表六：不同轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)的穩(wěn)定整合參數(shù)比較
表七：不同病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)的特性比較
病毒載體
經(jīng)典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細(xì)胞譜廣，效率高等特點(diǎn)并廣為研究人員熟知。它們的特點(diǎn)總結(jié)歸納如表一。
表一：六大病毒載體技術(shù)的比較
| 載體 | 感染廣譜性 | 靶細(xì)胞類型 | 表達(dá)形式 | 表達(dá)時(shí)間 | 免疫原性 | 外源片段容量(Kb) | 滴度(TU/ml) | 缺點(diǎn) |
| 腺病毒載體 | 高 | 分裂和非分裂 | 非整合 | 2-4周 | 高 | 36 | 1012 | 免疫原性高，瞬時(shí)表達(dá) |
| 腺相關(guān)病毒載體 | 中 | 非分裂為主分裂 | 非整合為主;整合 | 數(shù)年 | 無 | 4 | 1012 | 外源片段容量小 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 | 中 | 分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 8 | 108 | 不能感染非分裂細(xì)胞 |
| 慢病毒載體 | 高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 5－8 | 1010 | 外源片段容量小 |
| 狂犬病病毒載體 | 對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞侵染效率高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 無 | ||||
| 昆蟲桿狀病毒載體 | 中 | 分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 1012 | 感染譜數(shù)據(jù)庫還有待豐富 |
病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞的優(yōu)勢
通過表二，可以發(fā)現(xiàn)病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)方法相比非病毒載體，具備高效，廣譜，長期穩(wěn)定表達(dá)以及能用于動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞等幾乎所有優(yōu)點(diǎn)。
表二：不同基因傳遞方法的比較
| 載體/方法 | 適用靶細(xì)胞類型 | 基因傳遞廣譜性 | 動(dòng)物體內(nèi)基因傳遞能力 | 操作便捷性 | 細(xì)胞毒性 | 長期表達(dá)能力 | 引起免疫反應(yīng) |
| 化學(xué)試劑 | 1，部分貼壁細(xì)胞 2，部分懸浮細(xì)胞 |
低 | 極低 | 高 | 低到中 | 低 | 低 |
| 電轉(zhuǎn) | 1，部分懸浮細(xì)胞 2，部分貼壁細(xì)胞 |
中 | 可操作性低 | 中 | 低到中 | 低 | 無 |
| 病毒載體 | 1，幾乎所有貼壁細(xì)胞 2，幾乎所有懸浮細(xì)胞 3，幾乎所有非分裂細(xì)胞 |
高 | 高 | 高 | 低 | 高 | 低到中 |
病毒制備和感染：
腺病毒：
腺病毒基因組非常大，而且酶切位點(diǎn)非常少，導(dǎo)致很難直接制備腺病毒載體。通常通過使用穿梭載體在細(xì)菌或者包裝細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行重組從而將外源片段轉(zhuǎn)移到病毒基因組中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒載體后，其兩側(cè)為長片段重復(fù)序列(LTR)以及
腺相關(guān)病毒：
腺相關(guān)病毒載體含有反向末端重復(fù)序列(ITR)。輔助質(zhì)粒用來表達(dá)病毒包裝必須基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事項(xiàng)：
插入片段大小和插入片段性質(zhì)因素：一些插入片段的表達(dá)由于對(duì)宿主或者包裝細(xì)胞系有毒性從而使得滴度比較低。在這種情況下，使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。還有一些插入片段太大或者太小都可能導(dǎo)致病毒包裝效率不高。 添加輔助序列增加插入片段的大小或者對(duì)病毒進(jìn)行濃縮純化提高滴度。插入片段如果過大可以選擇容量更大的病毒包裝系統(tǒng)。
小竅門：
構(gòu)建分子病毒載體時(shí)，使用recA-細(xì)菌擴(kuò)增病毒分子載體。當(dāng)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞時(shí)，盡可能使用傳代次數(shù)低的細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
使用純度盡可能高的質(zhì)粒，最理想的是經(jīng)過氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒。收獲病毒后，推薦進(jìn)行病毒濃縮并使用病毒純化試劑盒或者氯化銫密度梯度離心純化。
小竅門：
用病毒去感染細(xì)胞時(shí)，加入polybrene會(huì)增加感染效率
小竅門：
將病毒凍存在-80°C。但盡量減少凍融次數(shù)，推薦分裝成單次使用量的小容量包裝。避免反復(fù)凍融3次以上。
表三：化學(xué)，物理和病毒載體方法進(jìn)行基因傳遞的具體優(yōu)缺點(diǎn)比較
基因傳遞方法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)
病毒載體 • 高感染效率，廣譜性高 • 制備復(fù)雜
• 適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)操作 • 對(duì)病毒載體質(zhì)量要求高
• 能高效感染體內(nèi)細(xì)胞 • 需要低溫(-80°C )儲(chǔ)存
• 可以在體內(nèi)感染特定細(xì)胞 • 價(jià)格偏高
• 易篩選細(xì)胞穩(wěn)定株 • 部分病毒載體對(duì)基因大小有容量限制
化學(xué)方法 • 部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高 • 廣譜性不高
• 易操作 • 部分試劑毒性大
• 對(duì)轉(zhuǎn)染基因大小容量限制小 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果差
• 試劑穩(wěn)定，易儲(chǔ)存
物理方法 • 對(duì)大部分體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高 • 需要購買昂貴設(shè)備
• 易操作 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果差
為什么是shRNA？
外源導(dǎo)入的siRNA結(jié)合RISC復(fù)合物的能力要比shRNA低10倍，雖然將siRNA的長度增加到29-30 nt可以增加結(jié)合RISC復(fù)合物的效率，但也增加了off target效應(yīng)，引起更多的非專一性基因干擾。shRNA由于模擬microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的優(yōu)缺點(diǎn)見表四。銳賽選擇使用病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾，并通過構(gòu)建shRNA穩(wěn)定株，能最大程度的避免使用體外化學(xué)合成的siRNA所帶來的一系列問題。
| siRNA | shRNA | 雙功能shRNA | ||
| RNA干擾片段運(yùn)輸 | 進(jìn)入體外細(xì)胞 難易程度 |
中等 (轉(zhuǎn)染效率依細(xì)胞而定，差異大) | 容易 (使用病毒載體) | 容易 (使用病毒載體) |
| 進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi) 細(xì)胞難易程度 |
低 (轉(zhuǎn)染效率依組織特性而定，且需要較高劑量，可能引起off target效應(yīng)) | 容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低) | 容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低) | |
| 進(jìn)入細(xì)胞的方式 | 化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染 | 化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo) | 化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo) | |
| 細(xì)胞內(nèi)代謝速度 | 強(qiáng)(48小時(shí)內(nèi)99%被降解) | 弱 | 弱 | |
| 作用機(jī)制 |
結(jié)合RISC復(fù)合物能力 | 弱 | 強(qiáng) (10倍強(qiáng)于siRNA) | 超強(qiáng) |
| 達(dá)到沉默效果需要的拷貝數(shù) | 高 | 低 (5個(gè)拷貝左右即可) | 超低 | |
| 脫靶效應(yīng) (off target effects) |
化學(xué)修飾能力a | 易修飾;修飾價(jià)格昂貴 | 無法修飾 | 無法修飾 |
| 免疫信號(hào)通路反應(yīng) | 中 (通過細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)涵體通路激活先天性免疫系統(tǒng)) | 弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng)) | 弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng)) | |
| 外源核酸對(duì)細(xì)胞的毒性 | 中 | 弱 | 弱 | |
| 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源RNA干擾系統(tǒng)的影響 | 中 (過量siRNA會(huì)增加飽和exportin-5運(yùn)輸內(nèi)源miRNA能力的風(fēng)險(xiǎn)性) | 中(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會(huì)增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風(fēng)險(xiǎn)性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染) | 中(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會(huì)增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風(fēng)險(xiǎn)性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染) | |
| 表達(dá)可調(diào)控性 | 可控表達(dá)程度 (時(shí)間和空間) |
低(可以通過結(jié)合特定的小分子或者大分子達(dá)到特異進(jìn)入某類組織細(xì)胞的目的，但無法做到可誘導(dǎo)沉默) | 高 (更換啟動(dòng)子) | 高 (更換啟動(dòng)子) |
| 安全性 | 體外和動(dòng)物體內(nèi) | 高 | 高 | 高 |
| 臨床 | 中 | 中 | 中 |
表六：不同轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)的穩(wěn)定整合參數(shù)比較
| 穩(wěn)定整合參數(shù) | 化學(xué)轉(zhuǎn)染法 | 物理轉(zhuǎn)染法 | 病毒載體法 | 轉(zhuǎn)座子 | |||||
| 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 | 電轉(zhuǎn) | 逆轉(zhuǎn)錄病毒 (MLV) |
慢病毒 | 腺相關(guān)病毒(Rep-) | 腺病毒 | 睡美人 轉(zhuǎn)座子 | |||
| 整合幾率(integration event/PFU/cell) | 10-8 | 10-6 | 10-2-10-1 | 10-2-10-1 | 10-3 | 10-6-10-4 | 10-2 | ||
| 整合位點(diǎn) |
重復(fù)序 列片段 |
非核基質(zhì) -嚕噗區(qū) |
核基質(zhì)區(qū) |
CpG島; 核糖體重復(fù)序列 |
由于整合率極低，所以很少 研究 |
TA位點(diǎn) (染色體附近結(jié)構(gòu)決定) | |||
| 轉(zhuǎn)錄起始區(qū) |
活躍表達(dá) 基因內(nèi) |
轉(zhuǎn)錄活躍區(qū) 表達(dá)調(diào)控區(qū) | |||||||
| 整合位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄活躍度 |
低 | 低 | 高 | 高 | 中 | 高 | |||
| 穩(wěn)定性 | 弱 | 中 | 強(qiáng) | 強(qiáng) | |||||
| 拷貝數(shù) |
多拷貝串聯(lián)分布5-數(shù)百個(gè)拷貝 | 30%單拷貝 |
通過控制病毒載體用量 可以達(dá)到單拷貝 |
通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件可以達(dá)到單拷貝 | |||||
| 獲得單拷貝細(xì)胞株的難易程度 | 難 | 中 | 易 | 易 | 易 | 易 | |||
| 表達(dá)強(qiáng)度/拷貝 | 低 | 低 | 高 | 高 | 高 | 高 | |||
| 插入失活宿主 內(nèi)源基因 |
低 | 低 | 低 | 高 | 仍處于研究中 |
高 | |||
| 插入激活宿主 內(nèi)源基因 |
低 | 低 | 高 | 低 | 低 | ||||
表七：不同病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)的特性比較
| 腺病毒 載體 |
腺相關(guān) 病毒載體 |
逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體 |
慢病毒載體 | 狂犬病 病毒載體 |
桿狀病 毒載體 | |
| 表達(dá)形式 | 染色體外， 瞬時(shí)表達(dá) |
染色體外，長期表達(dá) | 整合 | 整合 | 整合 | 染色體外，瞬時(shí)表達(dá) |
| 表達(dá)周期 | 2-4周 | 數(shù)月至數(shù)年 | >1年 | >1年 | >1年 | |
| 感染細(xì) 胞類型 |
分裂和 非分裂細(xì)胞 |
分裂和 非分裂細(xì)胞 |
分裂 |
分裂和 非分裂細(xì)胞 |
分裂和 非分裂細(xì)胞 |
昆蟲細(xì)胞; 哺乳動(dòng)物分裂細(xì)胞 |
| 細(xì)胞侵染 廣譜性 |
廣 |
對(duì)體內(nèi)分化組織細(xì)胞侵染效果更好 | 廣 |
廣 |
高效感染腦神經(jīng)細(xì)胞 | 中 |
| 可容納外源片段大小 | 36kb | 4kb | 8kb | 5-8kb | ||
| 滴度 (TU/ml) |
1012 | 1012 | 108 | 1010 | 1012 | |
| 病毒制備 難易程度 |
中 | 難 | 中 | 中 | 中 | 中 |
| 常見應(yīng)用 | 1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 2，基因治療 |
1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，動(dòng)物模型; 3，基因治療 |
1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，全基因組插入失活突變篩選; 3，功能細(xì)胞庫構(gòu)建 |
1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，基因治療 |
1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，基因治療 |
1，真核細(xì)胞蛋白表達(dá)(表達(dá)可溶性蛋白) |
| 安全性 | 高 | 高 | 中 | 高 | 中 | 高 |
- 探索生命的奧秘：染色體核型分析在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用
- ACSL4與多不飽和脂質(zhì)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)性
- 飲食如何在宿主棲息地與腸菌間牽線搭橋
- 案例應(yīng)用：合生素協(xié)同調(diào)節(jié)十五烷酸代謝改善腸道炎癥
- 案例研究：AD靶向藥GV-971如何對(duì)癥急性胰腺炎
- CosMx SMI揭示兒童期紅斑狼瘡腎炎有腎臟基質(zhì)與浸潤免疫細(xì)胞的互作
- 生物學(xué)家的機(jī)器學(xué)習(xí)基本術(shù)語和基本流程介紹
- CNVkit工具詳解：既簡又快地檢測外顯子拷貝數(shù)變異
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com