當需獲得高質量、多種參數(shù)的數(shù)據(jù)時，我們需要一種能夠進行復雜的基于細胞學檢測的儀器來提高數(shù)據(jù)獲取速度。這里我們通過一系列基于細胞學檢測的結果，來介紹一款將細胞成像系統(tǒng)和多功能微孔板檢測系統(tǒng)整合于一體的儀器，它即能夠提高檢測的通量，也能夠增加檢測數(shù)據(jù)的豐富度。此儀器即為Molecular Devices公司最新推出的SpectraMax® MiniMax™ 300，其標配有一個白色透射光通道和兩個熒光檢測通道。其專利的免染料標記的細胞檢測技術，可通過其白色透射光通道對微孔板內沒有標記的細胞進行精確計數(shù)，幫助分析細胞增殖、分化和化合物對細胞的毒性影響等情況。其標配的兩個熒光通道大大提高了此儀器的檢測范圍，包括檢測細胞增殖、轉染效率、細胞活力/細胞凋亡、細胞分化或者細胞周期。分析軟件中使用了全新的邏輯運算方式來識別細胞，可以簡化分析過程并且可輸出更多種參數(shù)數(shù)據(jù)：細胞數(shù)目、細胞匯合度、平均和完整的細胞面積、平均和完整的熒光信號強度。我們列舉了幾種基于細胞動力學檢測的實例。我們展示了如何利用全新的細胞成像系統(tǒng)來更好的服務于生物學的研究，基于此平臺的基礎上發(fā)展了幾種即適合生物制藥企業(yè)也適合研究中心的檢測方法。

SpectraMax® MiniMax™ 300細胞成像系統(tǒng)

·         可結合SpectraMax® I3多功能微孔板檢測系統(tǒng)；

·         熒光&透射光模塊；

·         簡便的操作來源于其全自動化設計

·         專有固態(tài)照明

·         高靈敏度的CCD相機

·         專有的激光自動聚焦方式

·         優(yōu)異均一性&對比度

·         專業(yè)的SoftMax® Pro軟件

 

 

根據(jù)Protocol要求將Hela細胞種在96孔板中(4000 cell/well)，使用抗癌化合物處理細胞48小時以后，用MinMax成像系統(tǒng)的透射光通道獲取細胞圖像，并且在無需染料的情況下，僅通過軟件的邏輯運算功能就可以對細胞進行計數(shù)或得出細胞覆蓋面積的百分比。使用SoftMax6.4軟件直接獲得IC50值，可在不同時間點進行數(shù)據(jù)的采集。

 

使用來自于Cellular Dynamics International(CDI)公司的由ipsc(誘導多功能干細胞)分化的肝細胞，按照其要求種在微孔板中。使用膠原包被的9 6 孔板， 其中細胞密度為60000 cell/well，或者使用膠原包被的384孔板，其中細胞密度為15000 cell/well，培養(yǎng)2-3天，然后用相應化合物刺激細胞72小時。使用Calcein(活細胞檢測試劑盒，Invitrogen)或者使用鬼筆環(huán)肽共軛連接的AF488(固定細胞，BD試劑盒)染料對細胞進行染色，使用MinMax成像系統(tǒng)獲得圖像后，利用軟件邏輯運算功能分析細胞的增殖情況。

 

將造血干細胞(CD34+細胞，Lonza)種在96孔板中，然后加入細胞因子指示劑和抗癌藥物后培養(yǎng)5天。使用Cell Tracker Green(Invitrogen)或抗血型糖蛋白A(anti-Glycophorin A)(BD試劑盒)。成像后的細胞，使用軟件自帶模塊來分析細胞的數(shù)目。

 

全新的SpectraMax MinMax 300成像系統(tǒng)可以幫助用戶按照自己的需要輕松設置試驗，然后快速進行檢測。此系統(tǒng)具有強大的獲取、分析圖像的功能， 得益于圖像分析行業(yè)領導軟件MetaMorph，我們將其核心分析功能整合進了SoftMax Pro軟件中。用戶可以根據(jù)自己特定試驗的需求從若干個應用模版中進行選擇，再去獲取和分析圖像。

 

 

透射光成像功能對于基于細胞學檢測的試驗非常具有吸引力，原因在于其無需標記，且僅需要較短的曝光時間，不同時間點都可以檢測且對細胞無損傷。然而，在透射光條件下對許多連接緊密的細胞進行分割是一個非常大的挑戰(zhàn)，因為細胞與背景的對比度很低，這樣就需要軟件具有強大的邏輯運算能力。這里，我們介紹具有專利的無標記細胞檢測技術，通過儀器的學習能力簡化圖像的分析設置，它可以適用于很多不同種類的細胞。

 

 

細胞增殖/毒性，通過癌細胞(HeLa)增殖情況來評價抗癌藥物的療效

透射光條件下的無標記細胞計數(shù)功能，進行細胞增殖試驗可在不同時間點獲得結果。使得可以選擇不同時間點記錄抗增殖藥物或者生長因子對細胞的作用效果，繪出濃度效應學曲線并給出IC₅₀s值，而且重要的是整個過程不需要染細胞進行觀察，試驗過程并不會影響細胞正常變化。

 

 

 

 

肝細胞毒性分析試驗使用誘導多功能干細胞(ipsc)分化的肝細胞作為研究對象。使用若干種肝毒性藥物對這些細胞處理72小時后，我們使用Calecin或者鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)的AF-488評價細胞的活力，毒性檢測的評價方法可以根據(jù)細胞區(qū)域面積變化或細胞數(shù)目的變化，黃曲霉毒素、十字袍堿、依托泊苷和其他肝毒性化合物的IC₅₀s值的確定，檢測試驗的窗口大約為200，Z值＞0.9。

 

 

我們設計出一個非常適合檢測生長因子和抗癌藥物對造血作用影響的試驗，我們將造血干細胞中加入不同的生長因子進行培養(yǎng)，此外，可以用來評價幾種抗癌藥物的作用效果，使用標記有FITC細胞系特異性的抗體進行染色或者使用細胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)。可以用于檢測許多表達譜系特異性標記物的細胞或全部細胞數(shù)目，IC₅₀s由不同因素所決定。試驗窗口(assay window)＞100，Z值＞0.7。

 

 

·         不同的細胞因子組合對CD34+細胞培養(yǎng)情況影響

·         使用細胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)(針對全部細胞進行計數(shù))或A型血糖蛋白(標記紅色祖細胞)

 

 

·         CD34+細胞培養(yǎng)時加入促紅細胞生成素(EPO)和抗癌藥物

·         細胞計數(shù)(擴增/毒性)