使用Ostro樣品制備產(chǎn)品從血漿中提取磷脂

Mark Ritchie，Mainak Mal和Stephen Wong
沃特世公司，新加坡

簡介：

多數(shù)“組學”研究的共同目標是鑒定疾病分子標記物、理解疾病作用機理，進而發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點。通常情況下，用于研究的體液因為與活體器官和組織密切接觸所以其對身體病理狀態(tài)特定反應非常靈敏。在脂質組學分析中，通常采用液液提取的方式對血漿的磷脂進行研究。過去也曾有固相萃取的應用。氨丙基硅膠柱也可用于分析脂質，但多著重于脂肪酸，或是會根據(jù)洗脫條件的不同進行篩選。Ostro 96孔樣品制備板則針對日常生物分析中的小分子進行研究，捕獲并去除樣本制備過程中大量的磷脂成分。在該通用流程中，脂質保留在Ostro板上，并不進行洗脫。對上樣和洗脫條件進行調整，就能實現(xiàn)選擇性富集特定類型磷脂或萃取全部磷脂。

實驗條件：

樣品制備：

人血漿樣本來源：新加坡國立大學生物科學中心志愿者，或商業(yè)樣本（Sigma，P/N P9523）。

萃取流程：

1. 將Ostro板放置在2 mL收集板上，并安置在真空裝置上。
2. 使用移液管將100 μL血漿直接上樣到Ostro板中。
3. 在孔中加入800 μL乙醇，使用移液管抽吸10次，確保樣本充分混合。
4. 混合過后，應用15˝ Hg真空條件，直至溶劑完全排空（約1分鐘）。
如在15˝ Hg條件下沒有流出液體，可采用更高的真空條件。
5. 重復步驟3和4，并將收集到的流量標記為“流穿”部分。
6. 從真空裝置中移除含有流穿部分的收集板，并重新安裝新板用于收集洗脫部分。
7. 加入800 μL洗脫溶劑（4.5:4.5:1/氯仿：甲醇：三乙胺）至孔中。
8. 應用15˝ Hg真空條件、直至溶劑完全排空（約1分鐘）。
9. 重復步驟6和7，并將收集到的容量標記為“洗脫”部分。
10. 對流穿和洗脫部分進行干燥（使用氮蒸發(fā)器，約1.5小時）。
11. 用200 μL 1:1（v/v）氯仿：甲醇復溶洗脫（E）和流穿（FT）部分。

注：請小心確保槍頭被放置在樣本板的指定位置，避免樣本流失或混合。

為便于比較，等量相同的人血漿使用Bligh-Dyer法1 進行萃取。鑒于不同的磷脂種類之間動態(tài)差異范圍極大，我們分析了兩種濃度的樣本：未經(jīng)稀釋的、用乙腈按照1/100比例稀釋的。采用帶有正負切換的多反應監(jiān)測方法，多反應監(jiān)測時間設定與特定類型磷脂1 的洗脫時間吻合。該方法的簡要介紹如表1所示。

采用預編程TargetLynx™方法對每種成分得到的信號自動積分。平均峰面積閾值設定為1000。

即將分析前，在樣本中加入外源性脂類內標作為空白對照，比較兩種樣本制備方法。該步驟是為了在計算方法或洗脫成分的相對提取率之前對數(shù)據(jù)進行標準化。加入的脂類及濃度如表2所示。

結果與討論：

對比使用Ostro樣品制備和Bligh-Dyer方法的萃取率

將混合的志愿者血漿進行萃取，每種兩份。因峰面積閾值設定為1000，為檢測脂類，MRM通道的峰面積至少要大于這一閾值。采用與后提取加標的同類型外源性磷脂的比率對每種脂類的峰面積值進行標準化操作。隨后，綜合同一方法的同一萃取液對這些比率計算平均分配值，使每個部分的脂類都能獲得唯一的標準值。隨后得出的Ostro流穿部分和洗脫部分的脂類數(shù)值去除以用相同脂類由Bligh-Dyer方法得出的數(shù)據(jù)，得到的結果就是每種脂類的萃取率。每種脂類的平均萃取率如表3所示。

鞘磷脂（SMs）、磷脂酰膽堿（PCs）和溶血磷脂酰膽堿（LPCs）都通過Ostro板完全保留，僅在洗脫液中出現(xiàn)。同種磷脂在兩種萃取方法中強度相同。

神經(jīng)酰胺（Cer）和磷脂酰甘油（PGs）則在相同條件下幾乎無親和力，主要在流穿部分中出現(xiàn)，只有非常少一部分被保留，并出現(xiàn)在洗脫部分。定性相同PG脂類，使用Ostro板的萃取率與Blgih-Dyer法相比，其峰面積更大。磷脂酰乙醇胺（PEs）和磷脂酰肌醇（PIs）表現(xiàn)一致，其萃取率在Ostro板上和Bligh-Dyer法一致，但在Ostro板上保留更強，在洗脫液中的含量略高。相同的溶血PE（LPE）類在兩種萃取方法中都有發(fā)現(xiàn)，但使用Ostro板得到的回收率只有Bligh-Dyer法的60%。另一方面，使用Ostro樣品制備則大大促進了溶血磷脂酰肌醇（LPIs）的萃取率，使用Ostro板比使用Bligh-Dyer法多觀測到5種脂類種類。多數(shù)LPI（90%）都沒有在Ostro板上保留�？傮w來說SMs、PCs和LPCs都能在Ostro板上進行保留，且洗脫溶液僅能為氯仿：甲醇：三乙胺（4.5:4.5:1）。其他類型磷脂在該條件下均不與板發(fā)生明顯保留作用，通過板并出現(xiàn)在流穿部分。

Ostro磷脂萃取方法的重復性

使用Ostro萃取市售人血漿的14份樣本。分析每種磷脂三份提取物樣本在流穿（FT）和洗脫（E）部分中的情況。計算每種脂類在所有復本中峰面積的相對標準偏差百分比（%RSDs），如表4所示。

如上所示的%RSD受離子強度影響，較少的類型卻在本實驗中產(chǎn)生了更多的誤差。相同閾值的情況下5，分析（LC-MS）方法的誤差在5%以內。

結論：

用于磷脂提取的Ostro樣品制備方法簡單且重復性好。使用這種方法在血漿中檢測到的磷脂種類數(shù)目和數(shù)量相比標準萃取方法（Bligh-Dyer）更好，Ostro板在LPIs和PGs的回收方面具備明顯優(yōu)勢。該方法適用于小型和大型脂質組學研究。鑒于Ostro板采用96孔式、無需離心，它也能被應用于通過液液萃取無法實現(xiàn)的實驗室自動化。相比液液萃取法，Ostro樣品制備法同時顯著降低了溶劑用量。該方法既能普遍應用于全部磷脂的萃取，亦可選擇性地萃取特定種類磷脂。例如，對流穿部分進行分析，可以研究含量較低的部分種類磷脂，而不會受到含量過大的PCs的線性范圍或者離子抑制作用的影響。

1. Bligh, E.G and Dyer, W.J.; Canad.J. Biochem. Physiol (1959) 27, 911-917
2. Zhao, Z and Xu, Y; J. Lipid Res (2010) 51, 652-659
3. Burdge et al.; British Journal of Nutrition (2000), 84, 781-787
4. Kim et al.; J. Lipid Res (1990), 31, 2285-2289
5. UPLC BEH HILIC: “T he Preferred Separation Chemistry for Targeted Analysis of
Phospholipids”, Mark Ritchie, Mainak Mal, and Stephen Wong. Waters Application Note
no. 720004219EN, January 2012.