引物篇：普通PCR 和 QPCR 引物異同點(diǎn)

瀏覽次數(shù)：14272　發(fā)布日期：2013-9-10　來(lái)源：http://www.biotnt.com/news/news_411.html

Q問(wèn)題：普通PCR 和 QPCR 引物是否一樣？

A 回答：二者的設(shè)計(jì)原則有相同也有不同；

相同處：

• 序列的查找是一致的；

• 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；

• 選取合適的擴(kuò)增片段大小

• 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；

• 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

• Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

• 引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃；

• 引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；

不同處：

Real time PCR 引物

• PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度；real-time PCR要求在300bp以內(nèi)，一般首選80-150bp 之間；

• 多對(duì)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來(lái)的引物條件會(huì)不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物；

• 目的基因含量比較低時(shí)，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物；

• 相對(duì)電泳法，Real time PCR靈敏度比較高，對(duì)引物的要求更高，引物二聚體要少；熔解曲線要求單一產(chǎn)物；

• Real time PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對(duì)定量，對(duì)擴(kuò)增的效率有要求；對(duì)引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)要求高；

普通PCR 引物：

• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，長(zhǎng)度一般是從150bp到幾千bp 不等；

• 對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)要求沒(méi)有real time PCR 高；

• 對(duì)擴(kuò)增效率要求不高；

• 可以選用梯度PCR 儀，選擇不同退火溫度，對(duì)引物退火溫度要求不需要一致；

驗(yàn)證時(shí)不同：

引物的特異性（相同點(diǎn)）：

Ø 引物的特異性在使用前用blast 來(lái)保證；

不同點(diǎn)：real time PCR

Ø 在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中通過(guò)熔解曲線來(lái)驗(yàn)證；

Ø PCR的特異性產(chǎn)物峰應(yīng)與引物報(bào)告中的PCR product 相差在兩度之內(nèi)；

普通PCR 通過(guò)產(chǎn)物的長(zhǎng)度，跑條帶，來(lái)鑒別產(chǎn)物的特異性；

Real time PCR 可以通過(guò)擴(kuò)增曲線，熔解曲線分析來(lái)鑒別產(chǎn)物的相對(duì)量，同時(shí)也可以對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，更全面，更科學(xué)！

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標(biāo)簽： PCR 和 QPCR

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