細菌內(nèi)毒素檢查法所用試劑的基礎(chǔ)知識

細菌內(nèi)毒素

醫(yī)院臨床在使用藥品注射劑時，常有發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、膚色灰白、休克、嚴重時導(dǎo)致死亡，這種癥狀稱為熱原反應(yīng)。

什么是熱原？目前國內(nèi)外仍未有統(tǒng)一的認識，但從國內(nèi)外文獻報道中，一個共同的意見，都普遍認為：它是指細菌內(nèi)毒素。歐洲藥典委員會副主席J.Van Noordwijk提出：“嚴格地講，不是每一種熱原都具有脂多糖的結(jié)構(gòu)，但所有已知的細菌內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性”。在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下，藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制一般可以接受的觀點是：不存在細菌內(nèi)毒素意味著不存在熱原。

細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復(fù)合物，它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產(chǎn)物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等）及其它微生物（如衣原體、立克次氏體、螺旋體等）的細胞壁層的脂多糖，其化學(xué)成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。

菌內(nèi)毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)(LPS)

 

 

細菌內(nèi)毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

細菌內(nèi)毒素標準品

細菌內(nèi)毒素國家標準品（RSE ）： 批號： 981 效價：9000EU
細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE ）： 以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價

細菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)

 

      細菌內(nèi)毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中國藥典明確注明：細菌內(nèi)毒素標準品溶液要混旋15min并且每稀釋一步要混旋30s，以充分混勻。

細菌內(nèi)毒素的耐熱特性

       由于細菌內(nèi)毒素要在高溫250℃ 30分鐘才能完全滅活，所以在制藥工業(yè)和一次性醫(yī)療器械及血袋等生產(chǎn)工藝中都是讓人頭疼的問題，檢測使用的各種玻璃器材均應(yīng)嚴格清除內(nèi)毒素后才能使用，我們提供的成品試驗器材要經(jīng)過7道嚴格工序才達到要求。

鱟試劑

 

      
       鱟試劑——從海洋生物鱟的血液提取的生物試劑，只有鱟血與內(nèi)毒素有特異性的凝膠反應(yīng)，該試劑達到了國際標準化，全世界均采用該試劑檢測細菌內(nèi)毒素，尚不能采用生物合成的辦法制造。其它的檢測方法受限與操作過于復(fù)雜或成本太高不能普及。

細菌內(nèi)毒素和鱟試劑生化反應(yīng)原理

 

       鱟試劑有兩條反應(yīng)通路，可檢測革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素和真菌產(chǎn)生的 1,3-(β,D)-葡聚糖，即可以間接檢測革蘭氏陰性菌和真菌的存在，目前試劑廠家可以提供分別針對于這兩種物質(zhì)的特異性鱟試劑。

鱟試劑的凝膠反應(yīng)過程觀測 

 

       使用光電檢測的原理進行檢測反應(yīng)曲線，即可進行定量檢測，目前已經(jīng)建立了完善的方法學(xué)和穩(wěn)定的檢測儀器。

檢測原理

光密度反應(yīng)時間(t0.02)取值方法

       BET系列儀器檢測試管內(nèi)反應(yīng)物的光密度OD值，取當OD上升到0.02的點的時間作為反應(yīng)時間，該點在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時間。

 

                                       吸光度限值法反應(yīng)時間

       理論分析和大量試驗表明，無論以哪種方法確定的反應(yīng)時間，它都是內(nèi)毒素含量的標志，內(nèi)毒素濃度和成膠時間為負相關(guān)，即內(nèi)毒素濃度越高成膠時間就越短。實驗證實，臨界時間t0.02與內(nèi)毒素濃度C-t0.02之間也是負相關(guān)。通過對標準品進行實驗，可得C-關(guān)系曲線，對該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。在對實驗品進行檢測時，根據(jù)試驗品的臨界反應(yīng)時間t0.02和式(2.3-2)，即可求出其內(nèi)毒素濃度值【1】。

 

                                                        反應(yīng)時間法定量測定原理

反應(yīng)速率測定及濃度計算方法

大量試驗表明，內(nèi)毒素濃度越高成膠時間就越快，即反應(yīng)速度快，將動力學(xué)反應(yīng)曲線變換成微分曲線，即反應(yīng)速率曲線。

 

                                                   反應(yīng)速率曲線

      其反應(yīng)速率最大的點即是反應(yīng)曲線的拐點，該點的時間作為反應(yīng)時間就是濁度反應(yīng)時間法中的t50，最大的反應(yīng)速率也與內(nèi)毒素含量相關(guān)，通過對標準品進行實驗，可得C-Vmax關(guān)系曲線，對該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。在對試驗品進行檢測時，根據(jù)試驗品的最大的反應(yīng)速率Vmax代入標準曲線方程，即可求出其內(nèi)毒素濃度值。

                                                                                                         反應(yīng)速率法定量測定原理

 

儀器直接鑒別葡聚糖存在的原理

        由鱟試劑生化反應(yīng)原理得知，葡聚糖與鱟試劑中的G因子直接反應(yīng)，然后產(chǎn)生凝膠，而細菌內(nèi)毒素與鱟試劑的C因子反應(yīng)，活化C因子再與B因子反應(yīng)然后產(chǎn)生凝膠，由于反應(yīng)得進程不同從反應(yīng)曲線上能夠發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別，內(nèi)毒素曲線為明顯的S型曲線，而葡聚糖曲線為接近直線的斜線，通過反應(yīng)時間法和反應(yīng)速率法的共同分析發(fā)現(xiàn)，含有葡聚糖的樣品檢測結(jié)果經(jīng)過兩種方法計算數(shù)值相差10倍以上，而內(nèi)毒素的檢測結(jié)果兩種分析方法沒有明顯區(qū)別。