Volker Andresen1,2, Stephanie Alexander1, Wolfgang-Moritz Heupel1, Markus Hirschberg1, Robert M Hoffman3 and Peter Friedl1,4

Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:1–9

 

    多光子顯微鏡是一種在深層（厚）組織切片或者器官中觀察細胞和細胞功能的一種方法選擇。這里我們介紹一種使用激發(fā)光波長大約為1080nm的紅外MPM IR-MPM的結(jié)構(gòu)和應用。相比于傳統(tǒng)MPM，IR-MPM可以使用紅色熒光團和熒光蛋白標記，成像深度加倍，改善了組織結(jié)構(gòu)的二次諧波產(chǎn)生，大大降低了光毒性和光漂白。而且，它可以在幾百微米深度提供亞細胞分辨率的成像，因此強化了活細胞的長時間成像和深層組織成像功能。

    MPM（多光子顯微鏡）是一種用于活體或活細胞研究的重要測量技術(shù)，可應用于神經(jīng)科學，免疫學和腫瘤研究。MPM的相對于其它成像方法的主要優(yōu)勢是它具備在活動物器官或組織內(nèi)觀察細胞運動，細胞-細胞間相互作用，和細胞內(nèi)信號傳遞的能力。與激光共聚焦相比，MPM將成像深度大幅提升，從幾十um到深達1mm在某種組織類型中，如大腦。相對激光共聚焦，更多的優(yōu)點在于其內(nèi)在的亞微米水平的空間分辨率可以允許揭示亞細胞水平的細節(jié)和精細的組織結(jié)構(gòu)；由于激發(fā)光的長波長，降低了散射和吸收，并顯著降低了離焦位置的光漂白和光毒性。而且，MPM能夠進行內(nèi)生熒光團的特征性紫外吸收波段激發(fā)和各向異性生物結(jié)構(gòu)，如具有了大的超級化率的膠原蛋白和骨骼肌纖維的二次諧波發(fā)生SHG。

    除了這些優(yōu)點外，多光子激發(fā)也具有顯著地局限性：在光學致密樣品，如包含結(jié)締組織和細胞豐富組織中的穿透深度仍然不夠，皮膚、淋巴結(jié)、肌肉、腎臟、和腫瘤；由于光的散射和光束輪廓的失真會導致成像深度增加的同時降低成像的空間分辨率；對敏感的細胞功能的光致毒性；對紅色和近紅外熒光團的激發(fā)不足。后者尤其重要，因為許多紅移熒光團已經(jīng)成為透過皮膚檢測活動物深層組織病變的標準傳感器，包括整個身體成像。一個補償熒光團激發(fā)不足的通用方法是將激光能量增強到高于無毒害水平。但是，一旦超過一個特定的激光水平，激光能量增加帶來的非線性光損傷增加速度快于激發(fā)光子數(shù)目的增加速度。因此強烈地增加了對敏感細胞和組織功能的光毒性傷害，如細胞分裂和信號傳導。

    為了克服NIRMPM現(xiàn)存的某些缺點，尤其是限制的組織穿透深度，光誘導的細胞損傷，和紅色熒光團的不良激發(fā)，此處我們描述了IR-MPM的結(jié)構(gòu)和在活細胞和皮膚內(nèi)深層組織成像、淋巴結(jié)和腫瘤損傷等方面生命科學的應用。

    通過使用一個光學參量震蕩器OPO作為紅外多光子光源，我們將多光子和二次諧波發(fā)生SHG顯微成像推向紅光波段。一方面，一個高重復率短脈沖的Ti：Sa激光器(Chemeleon XR, Coherent)產(chǎn)生710 to 980 nm的激光用于直接激發(fā)。另一方面，它作為一個基于非臨界相位匹配交互作用的周期性極化晶體內(nèi)的OPO(PP Automatic, APE)的泵浦光源 (Figure 1a). 光學參量震蕩是一個將短波長光束轉(zhuǎn)化為兩個長波長可調(diào)諧光束（信號光束和空閑光束）的非線性過程。對于一個 775 或 830 nm的泵浦波長，OPO信號光束光譜范圍為 1060 到 1450 nm.

    兩束光都通過光束整形裝置來控制它們的直徑、準直、脈沖長度和能量，之后進入一個優(yōu)化的可同時使用Ti：Sa和OPO激光的掃描頭(TriM Scope, LaVision BioTec)。光束通過一個雙色鏡被單軸混合，之后共同被一對檢流計掃描頭反射。所用物鏡(20 X IR,NA 0.95; Olympus)具有一個2mm長的工作距離可用于穿透深層組織，它被鍍膜且對從430nm到1450nm的一個寬波長范圍進行了修正。
系統(tǒng)性能和Ti:Sa與OPO激光的同時使用

    為了同時獲取樣品Ti：Sa和OPO的激發(fā)，一個分光器將Ti：Sa激光分解為泵浦OPO光束和直接成像光束(Figure 1a). 分光比例取決于足夠激發(fā)所需的光亮，先后依賴于樣品特征（光密度，連續(xù)性和熒光團吸收截面）和想要的成像深度。在實際應用中，一個90/10的分光比例對于泵浦OPO和直接進行Ti：Sa成像是有用的，可使830nm和1129nm的兩束激光分別在其激發(fā)焦點處產(chǎn)生大約100mw的能量

Figure 1 活體近紅外和紅外多光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及其空間解析 (a) 鎖模Ti：Sa激光器產(chǎn)生的光束(775 or 830 nm; 80 MHz;120 fs)被分解為泵浦一個OPO的光束和直接激發(fā)樣品的光束。OPO允許自動的軟件控制的波長調(diào)諧以及能量輸出穩(wěn)定性，通過使用一個整合的光譜儀和馬達驅(qū)動的腔室長度調(diào)節(jié)和一個馬達驅(qū)動的腔室末端鏡子實現(xiàn)。NIR和IR光束通過獨立的光束整形設(shè)備，每一個都包括一對交叉的起偏鏡(P)來控制激發(fā)能，一個望遠鏡(T)來調(diào)節(jié)光束直徑以適應焦平面后的物鏡尺寸，一個啁啾補償組件(C)補償由于物鏡和媒介光學元件導致的脈沖展寬。使用后者可以將物鏡(V Andresen, P Friedl, unpublished data)出口處的脈沖長度從380降低到120fs(Ti:Sa)和從270降低到120fs（OPO）。為獲得最大效率，OPO光路中的所有光學元件都進行了鍍膜并在波長延展段做了修正。兩束光通過一個二色鏡(DM; slope at 1020 nm)做了同軸混合，一起通過一對振鏡掃描器。發(fā)射信號在前向被一個1.4 NA的特殊的聚光器收集，在后向通過一個物鏡收集。光譜的分離通過分光鏡和每個光電倍增管PMT前的帶通濾波器實現(xiàn)。在前向與后向，激光通過遮光濾光片反射。縮寫: SL, 掃描鏡; TL, 場鏡; M, 鏡子. (b) IR-MPM側(cè)向和軸向的點擴展函數(shù)PSF。一個0.95NA的IR 20 X 物鏡和1100nm的激發(fā)光波長被用于激發(fā)小于分辨率極限的紅色熒光聚苯乙烯小球（分子探針）(100 nm). 焦點處能量為15mw，像素駐留時間為240ms，以收集到足夠的信號。通過對X，Y,Z的一維高斯擬合和半峰全寬計算PSF的尺寸。最終的PSF代表了視野中不同位置的15個獨立小球的平均值。

 

    IR-MPM的光學分辨率通過測量紅色熒光聚苯乙烯小珠的橫向和軸向點擴散函數(shù)PSF來確定。對于0.95N.A的20 x IR物鏡，激發(fā)光波長為1100nm時，水作為浸沒基質(zhì)，總計IR-MPM PSF的直徑是橫向564nm，軸向2240nm。這些值稍微大于理論數(shù)字，可能是因為對物鏡在長激發(fā)波長不的修正引起的，也再次確認了先前使用1500nm120fs的脈寬激發(fā)的數(shù)據(jù)。因此，IRMPM適用于提供接近光學衍射極限的圖像。

    在MPM中，熒光分子或蛋白被同時吸收的大于2個光子同時激發(fā)，它們共同為激發(fā)提供能量。這意味著最優(yōu)的光學激發(fā)波長大約是相應單光子激發(fā)的兩倍。因此，對紅色熒光團的激發(fā)效率顯著高于1100nm。

Figure 2 NIR和IR雙光子激發(fā)和釋放光譜。通過在同一焦平面對不同波長的Ti：Sa激光和OPO激光獲取多幅圖像并對掃描間的能量強度和漂白進行校正后的激發(fā)光譜。為獲取紅色和內(nèi)在熒光團以及SHG的釋放光譜，信號通過物鏡，光譜儀和CCD相機檢測。 (a) 自然狀態(tài)下，SDS-PAGE前后的表達細胞質(zhì)DsRed2 和組蛋白-2B-EGFP的HT-1080細胞.方框表明了光譜獲取的區(qū)域。(b) EGFP, DsRed2, 和 Alexa Fluor 660的雙光子激發(fā)光譜.實線代表了SDS-PAGE中分離的蛋白或Alexa Fluor 660，虛線代表了活的雙色細胞中的。計算的1100nm對DsRed2的激發(fā)效率比760nm要高20倍。(c) 活的非固定的HT-1080雙色細胞中830 nm對EGFP和1100 nm對DsRed2的同時激發(fā)。 Bars, 20 µm。

    從活的雙色人纖維肉瘤細胞HT-1080獲取的EGFP和DsRed的吸收和激發(fā)光譜展示了核EGFP/組蛋白-2B（H2B）和細胞質(zhì)DsRed，以及從細胞中導出通過電泳分離的分離蛋白。(Figure 2a).據(jù)報道，對EGFP最有效的激發(fā)波長為930nm，但在1060和1350nm之間沒有激發(fā)。相對的，DsRed在760nm處有一個小的激發(fā)峰，而從1090到1120nm處的激發(fā)效率是高于它20倍 (Figure 2b). Alexa Fluor 660表明在1070nm和1300nm間有一個1180nm的強激發(fā)峰(Figure 2b).

    使用兩個不同波長的光束進行成像，它們的焦點必須精確地重合到一起。水平方向的通過對一個參比結(jié)構(gòu)的成像如縱橫交叉的膠原纖維的SHG成像調(diào)節(jié)一束光相對另一束的傾斜來實現(xiàn)。為匹配軸向的焦點位置，將會用到OPO的光束整形設(shè)備中的望遠鏡(Figure 1a, ‘T’).當進行一個滑過均質(zhì)染料溶液的雙光束激發(fā)的3D堆棧時，望遠鏡進行調(diào)整直到斜率重疊。 而且，非完全重疊將可能會導致來自不同樣品平面的重像。使用EGFP和DsRed2在活的雙色HT-1080細胞的同時激發(fā)，小的褶皺和核內(nèi)結(jié)構(gòu)被以非常好的空間分辨率檢測到(Figure 2c),確定了IR-MPM在組織活細胞中高分辨率成像的應用。

    為同時激發(fā)熒光和其它特殊信號如組織結(jié)構(gòu)中釋放的SHG，用于混合激發(fā)的理想波長被確定。 由于SHG是一個非對稱性過程，前向的信后是后向信號的4到8倍；因此，熒光和SHG信號的配準分別通過透鏡和聚光器在后向和前向獲取。纖維狀膠原展示了來自一個輸入波長范圍最大1100和1189nm的窄的SHG帶寬 (Figure 3a). 與NIR在纖維狀真皮膠原產(chǎn)生的SHG信號相比，釋放光強度比1100nm激發(fā)(V Andresen, WM Heupel, P Friedl, unpublished data)的光強5-30倍。SHG對自發(fā)熒光的比值大約為500:1(Figure 3b),這超過了Ti：Sa激發(fā)的典型比值。因此1100nm是一個適用于同步激發(fā)DsRed2，Alexa Fluor 660, 和富含膠原組織的SHG信號的合適OPO波長。

    對于活細胞顯微成像，重復暴露在激光下會導致熒光團的光漂白，活性氧中間體的形成和熱，最終在成像靈敏度和細胞活性與功能間進行折中�；罴毎�在1100nm處對DsRed2的光漂白分別低于以880nm和760nm激發(fā)的4到10倍 (Figure 4a).在117mw的高激光能量情況下，活細胞中的EGFP和DsRed2分別在500和1700次連續(xù)掃描后發(fā)生聚集，分別對應760nm和880nm，3和10分鐘的連續(xù)照明(Figure 4b).作為對照，使用1100nm的激發(fā)波長進行10⁴次掃描或60分鐘的連續(xù)照明時間后沒有檢測到蛋白的聚集(Figure 4b). 為排除非結(jié)構(gòu)性和潛在的光損傷，由于肌動蛋白驅(qū)動的細胞遷移對能量依賴的即時性和對物理化學傷害的敏感性，檢測了這一過程。盡管樣品被暴露在1100nm的光下超過14小時(Figure 4c)，仍然沒有發(fā)生細胞遷移或激光誘導的毒性，包括細胞變圓，蛋白質(zhì)凝集或熒光的損傷。因此，IR-MPM展現(xiàn)了非常低水平的光漂白和光損傷。

Figure 3．IR雙光子二次諧波信號(a) 自然狀態(tài)人皮膚（左）中膠原蛋白豐富區(qū)域的SHG光譜（右）。方框，測量區(qū)域。(b) 1100nm處人類皮膚的釋放光譜。方框表明了角質(zhì)層，表皮和真皮中獲取光譜的區(qū)域。纖維狀膠原的SHG峰位于激發(fā)波長的一半處。

Figure 4．IR-MPM的光漂白，光毒性和組織穿透性. (a)以75mW能量的760, 880, and 1100 nm 激發(fā)波長連續(xù)掃描的釋放光的下降時測量的DsRed2光漂白。樣品被進行250次連續(xù)掃描，釋放光強度以整個掃描區(qū)域的平均像素強度量化，并對首幅圖像強度歸一化。虛線表明了1100nm處的以釋放光強度下降末端點進行歸一化的漂白效率(b) 持續(xù)激發(fā)導致的蛋白凝結(jié)。雙色HT-1080細胞在高激發(fā)能（110mW）和2.8幅/秒幀速下的連續(xù)成像。箭頭和星號表明了凝結(jié)蛋白的聚集。(c)1100nm波長以焦點處117mW的能量強度連續(xù)激發(fā)期間，真皮切片中的多細胞球體中的HT-1080細胞向外遷移沒有削弱。數(shù)字表明經(jīng)過的時間。通過細胞跟蹤獲得的種群周轉(zhuǎn)率與傳統(tǒng)亮視野顯微鏡下監(jiān)測的細胞比較。近乎完全重疊的遷移速率回歸曲線被展示。用于SHG（d）穿透深度測量的4mm厚自然狀態(tài)人皮膚切片和用于熒光（e）測量的直徑1mm的雙色HT-1080細胞球。對于二者，3維的皮膚或者多細胞球，880nm和1100nm以75mW能量的激發(fā)，SHG和熒光信號釋放被以完全相同的PMT靈敏度檢測。(d) and (e) 中的虛線展示了測得的50%的釋放光信號強度，以之作為歸一化的整個掃描區(qū)域的平均像素強度。標尺(c), 150 µm.

    雖然近紅外光與可見光相比，水只能很少的吸收，但是水會增加對大于900nm的激發(fā)光的吸收，因此造成了IR-MPM在活的含水豐富組織的生物化學方面應用�？紤]到這個因素，使用1100nm激發(fā)比880nm激發(fā)在人體皮膚纖維蛋白的原位觀察方面最大成像深度增加了2倍(Figure 4d). 同理，水性基質(zhì)中的DsRed2熒光細胞可以在固體多細胞球體結(jié)構(gòu)中2倍深度的層次中檢測到(Figure 4c).因此，如預先說的，IR-MPM適用于生物組織的更深層成像。

    因此，在移植的雙色HT-1080細胞中，移植入小鼠皮膚8天后，使用1100nm激發(fā)對DsRed2信號的檢測深度相對于使用880nm激發(fā)增加了2倍，可達500um（Figure 5a–c). 淋巴結(jié)內(nèi)CMTMR標記的樹突細胞從上皮層使用1100nm激發(fā)，成像深度可以達700um(Figure 6a–c).

    對于深層組織的多光子顯微成像的另一個嚴重限制是隨成像深度增加，空間分辨率下降。在使用近紅外激發(fā)的淋巴結(jié)中，50um的成像深度時圖像質(zhì)量比表面成像下降了2到5倍。 Figure 5d 表明即使有足夠的深層組織信號，細胞邊界和亞細胞細節(jié)的分辨率也會受到散射性腫瘤組織的強烈影響。但是，我們的測量結(jié)果表明，IR-MPM比NIR-MPM顯著降低了這種質(zhì)量下降 (V Andresen, P Friedl, unpublished data).因此，對某些深層的窗口，IR-MPM提供了無與倫比的成像質(zhì)量。

 Figure 5 活體中表達DsRed2的腫瘤移植物的IR深層雙光子組織顯微觀察。植入小鼠皮膚的人類雙色HT1080纖維肉瘤細胞，以75mW能量輸入的(a) 880 and (b) 1100 nm激發(fā)的3D堆棧。Z軸的步長為5µm。V顯示了一個大血管的區(qū)域（負對照） (c) 一個作為穿透深度功能的歸一化的熒光強度。與皮膚表面下10到50 µm損傷位置相關(guān)的強度曲線的初始斜率(d) (b)中虛線展示的與1100nm激發(fā)在Z軸穿透深度的增加相伴隨的空間分辨率的下降。插圖展示的是全景圖的細節(jié)放大。標尺 100 µm ((a) and (b)), 50 µm (d), and 20 µm ((d), 插圖).

    這些結(jié)果表明紅外雙光子和二次諧波產(chǎn)生顯微成像對于無毒害的時間分辨的細胞行為調(diào)查的深層組織成像尤其有利。作為與其它脈沖飛秒激光系統(tǒng)相比的優(yōu)勢，如Ch:forsterite (1230 nm) 和 Fianium fiber (1064 nm) 激光器，OPO產(chǎn)生的波長是可調(diào)諧的，適用于以一種彈性方式在它們的激發(fā)峰段對紅色和近紅外熒光團進行激發(fā)。由于沒有分辨率方面的主要損失，1100nm到1300nm波長范圍非常適用于紅色和近紅外熒光團，以及遺傳編碼的紅移熒光蛋白(DsRed2, mCherry, TurboFP) 的雙光子激發(fā)和寬帶SHG，然而與NIR激發(fā)相比，它的限制性水分吸收倍增了間質(zhì)組織和細胞豐富組織的穿透深度。

    強化IR-MPM的深入發(fā)展包括進一步的紅移遺傳編碼熒光蛋白的構(gòu)造；用于識別具有類似發(fā)射光譜的多光子熒光IR激發(fā)的熒光壽命成像研究；與光學相干層析的結(jié)合，用于預選感興趣的研究區(qū)域；合適的光學器件的補償。對于組織中的深層成像后者尤其重要，因為細胞膜，脂肪沉著體，及類似物造成的折射率局部改變削弱了激發(fā)波前，并因此顯著地削弱PSF。在這個雙光子顯微鏡中，不只是導致了圖像質(zhì)量的下降，而且導致了熒光的重大損傷，因為信號依賴于激光能量的平方。使用合適的光學器件和對給定深度進行一個單獨的形狀校正將會補償樣品產(chǎn)生的80%的畸變。

Figure 6  一個固定的淋巴結(jié)內(nèi)樹突細胞（DC）的3D重構(gòu)。在腘窩淋巴結(jié)抑制前24小時，將同源未成熟的CMTR陽性DC注入Balb/C小鼠的腳掌中。 (a) 一個880nm激發(fā)波長的重構(gòu)和(b)作為穿透深度功能的歸一化的紅色熒光(虛線區(qū)域的Z面測得). (c) 1100nm激發(fā)波長的重構(gòu)(d)400–700 µm深的深層T細胞區(qū)域處的XY切片。激發(fā)能為 110 mW (1100 nm) 和 180 mW (880 nm). 標尺，100 µm.

    利用三次諧波產(chǎn)生THG和OPO激發(fā)CARS（相干反斯托克斯現(xiàn)象）的IR多光子顯微成像對于原生狀態(tài)的細胞和組織結(jié)構(gòu)成像非常有用。三次諧波產(chǎn)生THG是一種由三階非線性過程產(chǎn)生的類似SHG的非線性光學顯微技術(shù)。因為非線性地依賴于激發(fā)能，THG具有內(nèi)在光學切片的特點。它與近紅外波長（1-2um）混合時非諧振的特性使得這種技術(shù)對于生物和非生物樣品成像非常有趣。

    Nd:vanadate或者Ti：Sa激光器與泵浦OPO共同使用將充分使得CARS成為一個原生狀態(tài)細胞和組織成像的有力工具。因此，Ti：Sa激光作為泵浦光束，而OPO激光作為CARS非線性過程的Stoks光束，適用于活細胞的脂類代謝和細胞器運輸方面的研究。

    同時使用綠色和紅色熒光團將會從當前的Ti：Sa和OPO系統(tǒng)發(fā)展中得到很多益處。最新的Ti：Sa激光器超過4W的一般特征性能量輸出可以提供給兩個激發(fā)光束幾個100mw的能量。最后，一個新的OPO晶體的產(chǎn)生將會在一個寬范圍調(diào)諧泵浦光束帶寬因此支持綠色和紅色熒光團的在各自激發(fā)峰同時激發(fā)�？傊�，越紅越好的普遍觀點對于深層組織雙光子顯微鏡在生物醫(yī)藥研究的寬的應用范圍內(nèi)是正確的。

 

 

1 University of Wu¨ rzburg, Rudolf-Virchow Center for Experimental Biomedicine and Department of Dermatology, Venerology, and Allergology, Josef-Schneider-Strasse 2, 97080 Wu¨ rzburg, Germany

2 LaVision BioTec GmbH, Meisenstrasse 65, 33607 Bielefeld, Germany

3 AntiCancer, Inc., 7917 Ostrow Street, San Diego, CA 92111 and Department of Surgery, University of California, San Diego, 200 West Arbor Drive, San Diego, CA 92103-8220, USA

4 Microscopical Imaging Centre, Department of Cell Biology, Nijmegen Center for Molecular Life Science, Radboud University Nijmegen Medical Centre, P.O. 9101, 6500 HB, Nijmegen, The Netherlands

Corresponding author: Friedl, Peter (P.Friedl@ncmls.ru.nl)