5-羥色胺ELISA試劑盒使用說(shuō)明
5-羥色胺ELISA試劑盒使用說(shuō)明
(德國(guó)IBL:RE59121)
1、 應(yīng)用范圍
此試劑盒可用于人血清、血漿、血小板和尿液中五羥色胺的體外定量檢測(cè)。進(jìn)一步的研究表明：此試劑盒還可用于組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。
2、前言說(shuō)明
五羥色胺是色氨酸代謝的中間產(chǎn)物，它主要存在于腸嗜鉻細(xì)胞、血清素激活的神經(jīng)元和血小板中，它已被確定為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)。循環(huán)血液中的五羥色胺幾乎都集中于血小板內(nèi)。循環(huán)五羥色胺濃度的變化可反映出人體的一些病理變化，這些病理變化包括：慢性肌緊張性頭痛、精神分裂癥、高血壓、舞蹈癥、杜氏肌肉萎縮癥和早期急性闌尾炎。血清五羥色胺的檢測(cè)對(duì)類癌綜合征的檢測(cè)具有重要臨床意義。人們預(yù)計(jì)：在不久的將來(lái)，人們對(duì)血小板內(nèi)五羥色胺的研究興趣（包括五羥胺的吸收及釋放動(dòng)力學(xué)研究）應(yīng)該會(huì)不斷增長(zhǎng)。
3、實(shí)驗(yàn)原理
樣品準(zhǔn)備（將五羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰五羥色胺）是樣品的稀釋的一部分，將每一份樣品分別于�；噭┮黄饻赜涂梢缘玫锦；奈辶u色胺。此實(shí)驗(yàn)采用的是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的原理，生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到一定數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。最后，結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量于樣品中被分析物的濃度成反比。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，洗板除去未結(jié)合的生物素標(biāo)記抗原，用抗生物素堿性磷酸酶做標(biāo)記、對(duì)硝基苯磷酸做底物來(lái)檢測(cè)結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量。用已知標(biāo)準(zhǔn)品做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣品的酶活性在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行定標(biāo)就可以得到未知樣品中五羥色胺的濃度。
4、貯存與穩(wěn)定性
試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。打開了的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。
5、樣品的采集與儲(chǔ)存
|
注意 |
有些食物會(huì)含有一定量的五羥色胺，另外，有些藥物也會(huì)刺激五羥色胺的釋放，從而導(dǎo)致五羥色胺的濃度升高。病人應(yīng)當(dāng)禁食富含五羥色胺的食物，如：阿司匹林、促腎上腺皮質(zhì)激素、MAO抑制劑、phenazetin、兒茶酚氨、利血平和煙堿。 |
血清
|
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測(cè)時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì)。 | ||||
|
貯存 |
18-25℃ |
2-8℃ |
≤-20℃ |
避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。 |
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穩(wěn)定性 |
2小時(shí) |
6小時(shí) |
3個(gè)月 | |
尿液
|
可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。確定用于結(jié)果結(jié)算的總體積。使用前請(qǐng)將所有樣品混合并離心。 | ||
|
貯存 |
≤-20℃ |
避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
|
穩(wěn)定性 |
6個(gè)月 | |
血漿、血小板
|
98%以上的循環(huán)五羥色胺都位于血小板內(nèi)，在血液凝集時(shí)就可以釋放出來(lái)。用靜脈穿刺的方法將全血收集到含EDTA或檸檬酸的塑料試管中（如10mlMonovette NC試管中加入1ml檸檬酸溶液）。
室溫下，將全血樣品以200×g的速率離心10分鐘得到富含血小板的血漿（PRP）。將PRP-上清轉(zhuǎn)移到另一試管中。
為了獲得血小板乳糜微粒，我們將200ulPRP（350000～500000個(gè)血小板/ul）加入到800ul生理鹽水中，之后4℃下以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）。離心后棄取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul雙蒸水，之后樣品就可以在-20℃以下的環(huán)境下凍存數(shù)周了。
將凍融的樣品在室溫下以1000×g的速率離心2分鐘。整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要使用20ul上清液（見�；�
如果您想測(cè)無(wú)血小板血漿（PFP）中五羥色胺的濃度，我們可以將PRP在4℃以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）就可以獲得無(wú)血小板血漿（PFP）。游離五羥色胺的ELISA實(shí)驗(yàn)要使用50ul上清液（見�；�
注意：PRP中五羥色胺的直接檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明：大約10%的PRP樣品可以檢測(cè)到不可預(yù)知的高濃度五羥色胺（結(jié)果用高效液相層析和流氏細(xì)胞術(shù)獲得）。為了避免這種差異性，我們建議您即檢測(cè)血小板中五羥色胺，也檢測(cè)無(wú)血小板血漿中的五羥色胺。 | ||||
|
|
無(wú)血小板血漿 |
血小板微粒(從血漿中分離得到) |
避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。 | |
|
儲(chǔ)存 |
≤-20℃ |
≤-20℃ |
≤-80℃ | |
|
穩(wěn)定性 |
2周 |
4周 |
1年 | |
組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清
|
使用組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般無(wú)特殊注意事項(xiàng)
注意：細(xì)胞培養(yǎng)基可能含有一定量的五羥色胺！ | ||
|
儲(chǔ)存 |
≤-20℃ |
避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
|
穩(wěn)定性 |
6個(gè)月 | |
6、試劑盒成分
|
注意 |
試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)所需的試劑成分。 |
|
數(shù)量 |
標(biāo)記 |
成分 |
|
1×12×8 |
MTP |
包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
|
1×5ml |
ANTISERUM |
組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的NaN3。 |
|
1×5ml |
BIOTIN |
五羥色胺生物素，黃色，即用，內(nèi)含0.1%的NaN3。 |
|
1×0.2ml |
ENZCONJ CONC |
酶聯(lián)物，10倍濃縮，內(nèi)含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體、Tris緩沖液、HCl和0.01%的NaN3。 |
|
1×7×0.5ml |
CAL A-G |
標(biāo)準(zhǔn)品A-G，0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml,0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l,即用，內(nèi)含�；奈辶u色胺、磷酸鹽緩沖液和0.1%的NaN3。 |
|
1×2×0.5ml |
CONTROL 1+2 LYO |
質(zhì)控品1+2，凍干，內(nèi)含人血清和0.02%的NaN3。具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽。 |
|
1×3ml |
ACYLREAG |
�；噭�
內(nèi)含乙酸酐和丙酮，即用 |
|
1×50ml |
ASSAYBUF CONC |
檢測(cè)緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、BSA和1%的NaN3。 |
|
1×50ml |
WASHBUF CONC |
洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
|
1×9× |
PNPP SUBS |
PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋內(nèi)，內(nèi)含對(duì)硝基苯酚磷酸鹽。 |
|
1×27ml |
PNPP BUF |
PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含二乙醇胺、水和0.05%的NaN3。 |
|
1×15ml |
PNPP STOP |
PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
|
3× |
FOIL |
粘性金屬板 |
7、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供
1） 移液器，體積：20;25;50;100;1000ul
2） 玻璃試管（12×75mm）
3） 試管架
4） 振蕩器（500rpm）
5） 旋渦混合器
6） 水浴箱，37℃
7） 帶儲(chǔ)器的8道移液器
8） 洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)
9） 離心機(jī)：≥1500×g
10） 可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長(zhǎng)：600-650nm）
11） 雙蒸水或去離子水
12） 吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器
8、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說(shuō)明
供手動(dòng)和自動(dòng)操作參考用
|
注意 |
用于96孔檢測(cè)的試劑成分可分成3次用。下述體積是使用4條（32孔）時(shí)所需要的體積。如果客戶想將標(biāo)準(zhǔn)品從7支減為6支的話，我們可以省掉標(biāo)準(zhǔn)品G。則檢測(cè)范圍相應(yīng)的減少到155ug/l（血漿）或706ug/l（血清，尿液，組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清）。
血清、尿液、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品可以選擇簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行，只需溫育3.5個(gè)小時(shí)（但血漿樣品不能采用簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行），以上樣品也可以選擇可選操作步驟進(jìn)行檢測(cè)（將樣品溫育一整夜），血漿樣品必須按照溫育一整夜進(jìn)行檢測(cè)。 |
8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備
|
稀釋/溶解 |
成分 |
加入 |
稀釋劑 |
比例 |
備注 |
儲(chǔ)存 |
穩(wěn)定性 |
|
15ml |
檢測(cè)緩沖液 |
150ml |
雙蒸水 |
1:10 |
出現(xiàn)黃褐色并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
2-8℃ |
2周 |
|
15ml |
洗滌液 |
300ml |
雙蒸水 |
1:20 |
|
2-8℃ |
4周 |
|
|
質(zhì)控品 |
0.5ml |
雙蒸水 |
|
靜置15min,混合時(shí)無(wú)泡沫 |
≤-20℃ |
有效期內(nèi)穩(wěn)定 |
|
60ul |
酶聯(lián)物 |
6ml |
稀釋的檢測(cè)緩沖液 |
1:101 |
臨時(shí)配置,只能使用一次 |
18-25℃ |
2小時(shí) |
|
3 |
PNPP底物片 |
8ml |
PNPP底
物緩沖液 |
|
臨時(shí)配置，只能使用一次 |
18-25℃ |
5小時(shí) |
8.2樣品的稀釋
樣品五羥色胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用檢測(cè)緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。
8.3樣品和質(zhì)控品的�；�
樣品A：血清，尿液，血小板提取物，組織勻漿和質(zhì)控品
樣品B：無(wú)血小板血漿
|
注意 |
請(qǐng)不要�；瘶�(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)�；�。
樣品準(zhǔn)備可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清被稀釋107倍，而血漿樣品則被稀釋23.5倍。結(jié)果計(jì)算時(shí)必須將此稀釋因子考慮進(jìn)去。 |
8.3.1樣品A：血清、尿液、血小板提取物、組織勻漿和質(zhì)控品
|
1 |
將質(zhì)控品和樣品A分別20ul加入到玻璃試管中。 |
|
2 |
在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
|
3 |
在每一試管中加入25ul�；噭�1（3%），加入后立即旋渦混合。 |
|
4 |
將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。 |
|
5 |
在每一試管中加入2ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合 |
|
6 |
1500×g下離心10分鐘 |
|
注意 |
準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。 |
8.3.2樣品B：無(wú)血小板血漿
|
1 |
將50ul樣品B加入到玻璃試管中。 |
|
2 |
在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
|
3 |
在每一試管中加入25ul酰化試劑，加入后立即旋渦混合。 |
|
4 |
將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。 |
|
5 |
在每一試管中加入1ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合 |
|
6 |
1500×g下離心10分鐘 |
|
注意 |
準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。 |
9、實(shí)驗(yàn)步驟
9.1簡(jiǎn)短操作步驟（僅供樣品A使用，不能應(yīng)用于血漿）
|
1 |
將標(biāo)準(zhǔn)品、�；玫馁|(zhì)控品和�；玫臉悠犯�50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
|
2 |
在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
|
3 |
在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
|
4 |
蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育90min。 |
|
5 |
移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
|
6 |
在每一微孔中加入150ul臨時(shí)準(zhǔn)備好的酶聯(lián)物。 |
|
7 |
蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
|
8 |
移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
|
9 |
如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
|
10 |
在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。 |
|
11 |
室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
|
12 |
在每一微孔中加入50ul PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
|
13 |
加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。 |
9.2可選操作步驟（溫育一整夜，樣品A和樣品B均適用）
9.2.1第一天
|
1 |
將標(biāo)準(zhǔn)品、�；玫馁|(zhì)控品和樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
|
2 |
在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
|
3 |
在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
|
4 |
蓋板，輕輕振板，2-8℃下溫育16-20小時(shí)（一整夜）。 |
9.2.2第二天
|
1 |
移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去參與液體。 |
|
2 |
在每一微孔中加入150ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。 |
|
3 |
蓋板，室溫振蕩器上（500rpm）溫育60分鐘。 |
|
4 |
移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
|
5 |
如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
|
6 |
在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。 |
|
7 |
室溫振蕩器上（500rpm）溫育30分鐘。 |
|
8 |
在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，振板以混合孔內(nèi)成分。 |
|
9 |
加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長(zhǎng)：600-650nm） |
10、結(jié)果計(jì)算
將所有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品的OD值減去空白孔的OD值。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（Y軸，線性）對(duì)其濃度（X軸，對(duì)數(shù)）繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用自動(dòng)計(jì)算的方法繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Cubic spline、4參數(shù)或雙對(duì)數(shù)可以得到較好的曲線圖。在計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)當(dāng)應(yīng)用到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值（兩個(gè)數(shù)值中，明顯逸出的數(shù)值應(yīng)當(dāng)被忽略掉，采用更加合理的一個(gè)數(shù)值用）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上定量得到。
由于樣品被稀釋了，所以最終樣品結(jié)果必須乘以相應(yīng)的稀釋因子，單位為ng/ml。
血清、尿液、血小板、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、質(zhì)控品： ×107
無(wú)血小板血漿： ×23.5
進(jìn)行了進(jìn)一步稀釋的樣品結(jié)果應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋因子。
實(shí)驗(yàn)必須滿足如下標(biāo)準(zhǔn)才符合要求：
50%OD/Odmax（ED50）：0.60-1.00ng/ml（平均0.8ng/ml）
△OD標(biāo)準(zhǔn)品A-標(biāo)準(zhǔn)品G≥0.80OD
轉(zhuǎn)換系數(shù)：
五羥色胺（ng/ml）×5.67=nmol/l
如果樣品中五羥色胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品，則此樣品必須按照實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備說(shuō)明進(jìn)行稀釋并重新檢測(cè)。
11、期望值
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作任何治療結(jié)果的唯一原因，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（97.5%）：
|
樣品 |
數(shù)量 |
單位 |
平均值 |
范圍 |
|
血清 |
99 |
ng/ml |
88.6 |
30-200 |
|
無(wú)血小板血漿 |
35 |
ng/ml |
3.7 |
1.8-7.5 |
|
血小板 |
35 |
ng/109血小板 |
490 |
217-861 |
|
24小時(shí)尿液 |
49 |
μg/d |
83.1 |
≤200 |
（建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍）
本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
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