人衰老成纖維細胞經(jīng)紫外線損傷后的DNA 修復(fù)和細胞周期調(diào)控
人衰老成纖維細胞經(jīng)紫外線損傷后的DNA 修復(fù)和細胞周期調(diào)控
段建明 張宗玉 童坦君
(北京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 北京 100083)
摘要 以體外培養(yǎng)的不同代齡的人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS) 為對象, 紫外線誘導(dǎo)DNA 損傷后, 觀察細胞形態(tài)、增殖特性、細胞周期、DNA修復(fù)變化等細胞應(yīng)答以及gadd153、p21、p53 等基因的轉(zhuǎn)錄水平的表達變化. 結(jié)果顯示: 紫外線誘導(dǎo)DNA損傷后, 衰老(>55代) 2BS 細胞形
態(tài)及增殖能力的改變不如年輕細胞(<30代) 顯著; 不同代齡的細胞損傷后均出現(xiàn)G1 期阻滯現(xiàn)象, 年輕細胞G1 期阻滯率明顯高于衰老細胞(P<0105) ; 衰老細胞總的修復(fù)能力較年輕細胞明顯下降(P<0101) ; 同時, gadd153、p21、p53 等的可誘導(dǎo)性均低于年輕2BS 細胞. 由此, 分別在細胞水平與基因水平反映了衰老細胞經(jīng)紫外線照射損傷后的細胞應(yīng)答變化與修復(fù)機能減退的關(guān)系.
關(guān)鍵詞 衰老細胞,DNA 損傷修復(fù), 細胞周期, 檢驗點控制
DNA 損傷的積累及修復(fù)能力的下降是生物衰老的重要原因之一[1]. p53、p21 和ATM 是近年發(fā)現(xiàn)的人類細胞3個DNA 損傷應(yīng)答的檢驗點控制(check2point control) 基因[2]. p53、p21 不僅作為抑癌基因發(fā)揮重要作用, 且在DNA 損傷的細胞應(yīng)答中起中心調(diào)控作用, 它們可調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)、細胞周期阻斷以及細胞凋亡等諸多基因的轉(zhuǎn)錄[3]. DNA損傷可誘導(dǎo)基因中的gadd45、gadd153與DNA 損傷后的細胞周期阻滯以及修復(fù)也密切相關(guān), 可能作為p53的下游基因而起作用[3]. 這些基因在衰老細胞中有無表達變化及與衰老細胞修復(fù)能力的下降是否有關(guān)? 至今未見國內(nèi)外報道. 我們以體外培養(yǎng)的人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)為對象, 研究了紫外線照射后衰老細胞中的DNA 損傷可誘導(dǎo)基因gadd153 以及檢驗點控制基因p21、p53的表達變化,及其與DNA修復(fù)能力和細胞周期變化的相關(guān)性.
1 材料與方法
1.1 材料及主要試劑 人胚肺二倍體成纖維細胞引自衛(wèi)生部生物制品研究所, pB luesSK 質(zhì)粒(gadd153 cDNA ) 由北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院惠贈,p21WAF1.CIP1. SDI1cDNA由美國Baylor 醫(yī)學(xué)院惠贈,p53及B2act in cDNA 探針為本室留存. DMEM干粉培養(yǎng)基: GIBCO.BRL公司, 胎牛血清: 北京北郊農(nóng)場血液制品所, 3H2TdR 及A232P dCTP: 北京亞輝生物工程公司, P rim e2a2Gene Lebeling System:Promege公司, 羥基脲、鮭魚精DNA、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白: Sigma公司, 其它試劑均為Sig2ma產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純.
1.2 細胞培養(yǎng) 人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中, 37℃溫育箱中生長, 傳代至62±4 代及24±6 代分別作為衰老及年輕細胞使用.
1.3 細胞形態(tài)及增殖特性觀察 細胞生長至對數(shù)生長期后, 細胞懸液調(diào)整至1×104細胞.ml, 移入24孔板中培養(yǎng), 待細胞貼壁后以紫外線(0145J.m 2.s) 照射5 min 損傷細胞[4],更換新鮮培養(yǎng)液于37℃溫育, 每12h觀察細胞形態(tài)變化并進行細胞計數(shù), 以未進行紫外線照射的衰老及年輕細胞作對照.
1.4 細胞周期分析 紫外線照射劑量、時間同上,37℃溫育24h后胰酶消化, 收集細胞, 再用RNA 酶于37℃消化1h, 然后用碘化丙啶(PI)染色, 以Bec2ton2Dickinson 流式細胞儀進行FACScan(fluo res2cence act ivated cell sorting)分析, 以未進行紫外線照射的衰老及年輕細胞作對照。
1.5 UDS (un scheduled DNA syn thes is) 測定 細胞計數(shù)后, 以1×105 細胞.孔傳于6孔板, 待細胞完全貼壁后,以含015% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓細胞72h使細胞同步化,更換含5mmo l.L羥基脲的無血清DMEM 培養(yǎng)液于37℃溫育1h后,紫外線照射, 其劑量與時間同上,更換培養(yǎng)液(含5mmo l.L 羥基脲、1LCi.m l3H2TdR、10%胎牛血清的DMEM) , 37℃溫育不同時間收集細胞,進行3H2TdR計數(shù), 對照組為未進行紫外線照射的細胞[5]。
1.6 斑點及Northern 印跡雜交細胞處于對數(shù)生長期時進行紫外線照射,時間、劑量同上, 然后于37℃溫育不同時間收集細胞, 用異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA,然后轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記探針及進行斑點和Northern 雜交[6,7] , 以未進行紫外線照射的細胞為對照. 雜交結(jié)果由積分光密度掃描分析。
2 結(jié)果
2.1 細胞形態(tài)及增殖特性的比較 紫外線照射前可見衰老2BS細胞形態(tài)與年輕細胞明顯不同, 衰老細胞胞體肥大、胞漿內(nèi)顆粒增多、胞漿混濁、折光性下降、細胞排列極不規(guī)則; 而年輕細胞則胞體細長、胞漿清亮、細胞呈漩渦狀排列. 紫外線照射后, 衰老細胞形態(tài)變化不十分明顯, 僅見胞漿內(nèi)顆粒略顯增加; 而年輕細胞則可見胞漿顆粒明顯增多、胞漿透明度下降、胞體也略顯增大, 但培養(yǎng)約1周后細胞形態(tài)基本恢復(fù)正常. 紫外線照射前后細胞生長曲線見Fig.1, 經(jīng)紫外線照射后年輕細胞增殖速率受到明顯抑制, 但約6d后增殖能力恢復(fù)正常; 衰老細胞增殖速率明顯低于年輕細胞, 紫外線照射前后增殖變化不十分明顯。
212 細胞周期時相變化 紫外線照射后衰老及年輕的2BS 細胞均可見G1 期阻滯, 而年輕細胞G1 期細胞阻滯率高于較衰老細胞(P<0105) (Fig.2).
213 DNA 修復(fù)能力比較 以3H2TdR 參入法測定非程序性DNA 合成(UDS) , 以表示DNA 總修復(fù)能力. 從F ig. 3 可見, 在紫外線照射后12 h 左右UDS達峰值. 衰老2BS 細胞的修復(fù)能力明顯低于年輕細胞(P < 0101).
214 斑點及Northern 印跡雜交結(jié)果分析 由斑點雜交結(jié)果可見, 紫外線照射6 h 后gadd 153 表達達峰值, 衰老細胞的gadd 153 可誘導(dǎo)性明顯低于年輕細胞, 結(jié)果見(Fig. 4). 根據(jù)斑點雜交結(jié)果選取紫外線照射后6 h 收集細胞, 進行Northern 雜交, 結(jié)果顯示(Fig. 5) , 紫外線照射后衰老細胞中g(shù)add153、p 53、p 21 基因的可誘導(dǎo)性均明顯低于年輕細胞, 但其中p 53 誘導(dǎo)性改變最小. 另外, 這三種基因在紫外線損傷前的基本表達在衰老細胞及年輕細胞中也有所不同, 其中p 21 在衰老細胞中的基本表達明顯高于年輕細胞, gadd153 的表達在衰老細胞中似略高于年輕細胞, 而p53 的表達差異不顯著.
3 討論
細胞衰老是一個多因素、多途徑所致的復(fù)雜結(jié)果,DNA 損傷的積累及修復(fù)能力的下降可能是細胞衰老的重要原因之一[8] , 在DNA 受損后衰老細胞應(yīng)答與年輕細胞有所不同. 衰老細胞的形態(tài)及增殖曲線的改變不明顯, 同時其恢復(fù)也緩慢. 流式細胞計檢測結(jié)果顯示, 衰老細胞G1 期阻滯率的增加幅度低于年輕細胞; 同時衰老細胞的DNA 修復(fù)能力顯著低于年輕細胞. 這些結(jié)果都說明衰老細胞對于DNA 損傷的應(yīng)答能力明顯不如年輕細胞. 那么, 衰老細胞對DNA 損傷的應(yīng)答能力下降的根本原因是什么呢? p53、p21 和gaddl53 等基因表達狀況在紫外線照射前后的變化可能為我們提供了一些有價值的線索.
DNA 損傷后, 會通過一定的信號傳導(dǎo)途徑引起細胞反應(yīng), 誘導(dǎo)眾多基因表達的激活或抑制,DNA 修復(fù)系統(tǒng)的激活則是細胞維持自身功能完整性和細胞生存的一個重要機制[ 9 ]. p 53 在DNA損傷監(jiān)控中處于檢驗點控制的位置, 起著中樞作用,p21 及gadd153 均為其下游基因, 它們有著部分共同的途徑, 又可通過各自不同的途徑作用于細胞周期及修復(fù)系統(tǒng), 在DNA 損傷修復(fù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中既互相協(xié)同又相互影響, 發(fā)揮著各自不同的作用[9]. p21是周期蛋白激酶的抑制因子,作為p 53的下游基因, 在p 53與細胞周期調(diào)控之間起橋梁作用. p 21的高表達會導(dǎo)致細胞周期阻滯, 還會通過與PCNA (增殖細胞核抗原) 相作用影響DNA 的復(fù)制及其修復(fù)[3]. gadd153 在紫外線的誘導(dǎo)表達中也是依賴于p53的, 它作為p53 的下游基因,一方面對損傷后的細胞周期有一定影響, 另一方面可能與DNA 損傷修復(fù)偶聯(lián). 有文獻報道, gadd153對轉(zhuǎn)錄因子C/EBP (CAAT增強子結(jié)合蛋白) 家族有負調(diào)控作用[10]. 實驗結(jié)果顯示, 經(jīng)紫外線損傷后無論年輕及衰老細胞出現(xiàn)的G1 期的阻滯同時伴隨著gadd153、p 21、p 53 基因的高表達, 這說明這三種基因的可誘導(dǎo)與細胞周期阻滯有著直接的關(guān)系; 然而, 有趣的是衰老細胞在紫外線照射前即存在明顯的G1 期阻滯, 此時僅見p 21 的高表達, 這說明p 21對衰老細胞G1 期的阻滯可能起主要作用, 而p21的高表達是因為衰老細胞中存在的損傷累積不能被有效修復(fù)所致. 因為衰老細胞本身即存在明顯的G1期阻滯, 加之p 53、gadd153, 尤其是p 21 基因的誘導(dǎo)性下降, 可能是衰老細胞G1 期增幅低于年輕細胞的原因. 同時, 衰老細胞修復(fù)能力的下降也可能與gadd 基因(包括gadd153, gadd45 等)、p 21 及p 53 等基因的DNA 損傷后的可誘導(dǎo)性在衰老細胞中的下降有關(guān). 實驗結(jié)果顯示, 衰老細胞中雖然p 21 這一細胞周期抑制因子的高表達導(dǎo)致了細胞的G1 期阻滯, 為修復(fù)損傷爭取了時間, 但其它與修復(fù)直接相關(guān)的基因卻不能有效地表達和發(fā)生作用. 實驗中還發(fā)現(xiàn), p 53 表達變化并不十分顯著, 說明p 21 在衰老細胞中的高表達有可能通過非p 53 途徑調(diào)控[ 10 ]; 但另一方面這可能與p 53 作用通過磷酸化狀態(tài)的改變而實現(xiàn)有關(guān)[ 11 ] , 在損傷誘導(dǎo)后, p 53 蛋白與各種基因的結(jié)合活性可能通過其磷酸化狀態(tài)的改變而有所改變, 這同樣可能是衰老細胞中p 53 未見顯著高表達的原因之一. 然而, 這幾種基因在衰老細胞中的損傷可誘導(dǎo)性下降卻具有一致性, 這可能正是衰老細胞在DNA 損傷后細胞周期調(diào)控能力及修復(fù)能力下降的根本原因之一. 總之, 探討衰老細胞在DNA 損傷后細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及DNA 損傷可誘導(dǎo)基因的表達改變, 有助于DNA 損傷修復(fù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的闡明, 對于揭示DNA 損傷修復(fù)與細胞衰老的關(guān)系具有重要的理論意義.
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