禽流感病毒的分離、鑒定和診斷
禽流感病毒的分離、鑒定和診斷
YU.05.1
一、什么是禽流感？
禽流感（AI）是由A 型流感病毒（AIV ）引起的禽類疾病綜合癥。禽類感染AIV 后表現為：輕度上呼吸道感染、精神萎縮、食欲減退，有類似人類A 型流感的癥狀。初期還會引起肉用雞停止增重，蛋雞產蛋量大大下降，種蛋孵化率下降等。發(fā)病很急，很短時間就會發(fā)展到全身致死性疾病綜合癥。AIV 廣泛存在于家禽和野生禽類，臨床癥狀易與ND （Newcastle disease, 新城病毒）、IB（雞傳染性支氣管炎）、EDS-76 （病毒引起的雞產蛋下降綜合癥）相混淆。雖然AI 的毒株大部分都不是高致病力毒株，但由于A 型禽流感的抗原（特別是血凝素抗原）易發(fā)生變異，變異后的毒株會變成高致病力的病毒，造成嚴重危害。此外AI 還會傳染給高危人類（如飼養(yǎng)者，運輸者，禽醫(yī)，禽類流行病專家等），造成人類禽流感，其危害更大。
二、歷史：
人類在十九世紀前對禽流感沒有深入認識和研究，當時禽類飼養(yǎng)也沒形成大規(guī)模企業(yè)生產，一般小型飼養(yǎng)戶把AI 統(tǒng)稱為禽類瘟病，流行也是局部的，危害有限。但1878 年，意大利的AI 大規(guī)模流行（可能是高致病力毒株引起）到百年以后1983－84 年美國大流行（已經確認是高致病力毒株H5N2 引起）再到2004 年亞洲→美洲的大流行表明AI 發(fā)生了變異，它是由AIV 的纖突中血凝素（HA）的抗原發(fā)生變異形成的，和人類A（甲）型流感一樣，僅僅是HA 抗原蛋白的一個氨基酸發(fā)生了變異就使得毒株的致病力發(fā)生了很大的變化。
現在，對禽流感的認識已經前進了一大步，AIV 的蛋白質、酶、和核酸種類及序列已被查明。禽流感疫苗已在各國生產。對AIV 的生物學診斷技術的研究已發(fā)展到了分子生物所階段。在我國，正在研究制訂流行病學檢測方法和制訂早期快速診斷技術規(guī)程。
三、AIV 的分離、鑒定和診斷：
I. 分離純化和觀測：
采集氣管粘液或泄殖腔粘液，或病變組織（呼吸道、消化道），加純水制作勻漿（10％ 懸液），低速冷凍離心機（臺式或立式均可）3,000~4,000rpm, 4℃～5℃，15～20 分，棄沉淀，即得到粗制的病毒液，可用負染法處理（用毛細管吸取懸液，滴在帶有支持膜的銅網上，根據懸液內樣品的濃度可立即或放置數分鐘后，用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，然后滴上負染液（常用重金屬鹽配置：如PTA（磷鎢酸）、KPT（磷鎢酸鉀）、NaPT ( 磷鎢酸鈉)、醋酸鈉、甲酸鈉、鉬酸銨等等）、染色時間1～2 分鐘，然后用濾紙吸去染液，待干燥后上透射電鏡觀測。
如果粗制液中病毒成份極少，透射電鏡觀測不到，則可把懸液用離心濃縮儀濃縮；或用超速離心機，固定角式轉頭40,000rpm ×45 分鐘，5℃取沉淀制成懸液上電鏡觀測�；蛴�40,000rpm 的甩平轉頭，30％～50％W/W 線性蔗糖梯度32,000rpm×50 分，5℃，病毒集聚在1.15～1.18g/cm3 之間的某個位置形成純樣品區(qū)帶；或用Ficoll,30％～40％W/W 線性梯度，病毒沉降在1.13～1.15 g/cm3 之間；或用Percoll 作平衡等密度離心，自形成梯度，病毒懸液與Percoll 混合，初始密度1.05 g/cm3，用0.01M Tris-HCL 作滲透平衡液，超速離心甩平轉頭P28S（日立）或SW28（貝克曼）轉頭，20,000rpm×30 分鐘，5℃。病毒在1.06 g/cm3 附近形成純樣品區(qū)帶。當然，也可以用溴化鈉（鉀）或碘化鈉（鉀）梯度進行禽流感病毒的純化。
對于一般單位，由于設備限制為了達到分離鑒定的目的可用下面程序：
病毒組織低速離心后的懸液，經過離心濃縮儀處理濃縮到原來體積的1/3~1/4 后接種于9～11 日齡雞胚，每個雞胚注射0.2ml,35℃±2℃培養(yǎng)三天。收集尿囊液及羊水測定其血凝活性，若為陰性則繼續(xù)盲傳2～3 代，對具有血凝活性的尿囊液先用ND（核抗原）抗血清作HI 試驗以排除新城病毒（New Castle Virus ）的可能性。ND 陽性的樣品也要采用中和法傳代， 看看是否為ND 與AIV 混合感染。然后用免疫法來檢測特異性核抗原NP 或MP，接著用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗來鑒定A 型禽流感病毒亞型。分離鑒定的同時還要進行致病力試驗，確定毒力強弱。
和人類流感致病病毒一樣，病毒的分離、純化、鑒定、診斷都是比較復雜的操作，但對于哺乳類脊椎動物來說，致病病毒有相當多具有構造相似、分離純化方法也基本相同，但診斷技術就常有較大的差異。
純化的病毒可用透射電鏡作進一步觀察研究，一般用負染或超薄切片選擇較小的物鏡光闌（增加反差），較高的加速電壓（80～100）KV，放大倍數一般為15 萬～20 萬倍，可以清晰地觀察到病毒形態(tài)。
病毒裂介和進一步對血凝素，神經氨酸酶，RNA 及其他蛋白質，酶進行分離純化后，可進行病毒的部分基因或全基因序列測定，以鑒定病毒的變異程度和生產有效的疫苗。
II. 禽流感診斷技術：
禽流感診斷技術可分為血清學診斷技術和分子生物學診斷技術。
① 血清學診斷技術
l HA( 血凝素)HI（血凝素免疫）試驗：常用于AIV 的HA 亞型鑒定的方法。試驗繁瑣，特異性好。但由于用已知HA 型的血清不能檢出新的HA 亞型的AIV，所以該方法有一定局限性。l 神經氨酸酶抑制試驗：（NW）：用于AIV 另一種表面抗原，即神經氨酸酶的亞型鑒別。80 年代后期已逐漸采用96 孔板微量NIT 試驗法，此法不僅可降低Ag（抗原）用量，而且可以對多種分離物進行Ag 分類。WHO（世界衛(wèi)生組織）推薦此法用于NA 亞型分類。用1－9 型NA 抗血清加入各種試劑，經實驗處理后用顏色來鑒別NI 的陽性和陰性。根據結果可判斷AIV 的NA 亞型。注意，為了避免病毒擴散污染危險，HA,HI,NIT 試驗都必須在P2~P3 級試驗室進行。
l 病毒中和試驗（VNT）:試驗操作繁瑣，臨床上很少使用，但作為經典方法，它可以作為其他新的檢測方法的比較標準。
l 瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）：AGP 是在瓊脂凝膠中進行的抗原抗體免疫沉淀反應。簡便、快捷，既可定性又可以定量，70 年代以后開始將AGP 用于禽流感Ab 檢測。由于禽流感不同亞型均具有共同的型特異性Ag，保守性很強，基本不發(fā)生變異，所以可以用一種禽流感的Ag 或Ab 對所有A 型AIV 的Ab 及Ag 進行檢測。AGP 常用免疫雙擴散法。Ag 制備法可參考三I 節(jié)的懸液制備或用超速離心濃縮純化，福爾馬林滅活制備Ag 效果很好。在瓊脂板中加入3％的PEG-6000，可以提高AGP 的敏感性。除以上方法外，免疫單輻射擴散試驗、單輻射溶血試驗，對流免疫電泳等也常用于AIV 及其Ab 的檢測。但這幾種試驗都需在凝膠中進行，敏感性差。AGP 所需試劑及Ag，Ab 量較大，限制了它的使用。
l 免疫熒光技術（IFT）：60 年代開始用于人流感快速診斷，80 年代美國爆發(fā)了禽流感時，將IFT 首次用于AIV 檢測。診斷時應注意避免或降低樣品中出現的假陽性，即非特異性熒光問題。
l 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：80 年代開始用于AIV 亞型檢測，20 年來各國學者對此法進行了多種研究和改進，已有試劑盒出售。目前ELISA 已成為AI 流行病學普查及早期快速診斷最有效，最實用的方法。
② 分子生物學診斷技術： 近年來，分子生物學技術已被大量應用于AI 的快速診斷。PCR ，和我國學者創(chuàng)建的逆轉錄－聚合酶鏈反應即RT-PCR 具有高度特異性和靈敏性。此外，用單克隆抗體在免疫過氧化酶染色組織中定位病毒抗原；基因探針原位染交可定位組織中參與病毒復制的感染細胞；核酸分子雜交可檢測病毒的核酸等等都有很好的應用前景。
四、展望：
目前我國學者正在研究和完善禽流感的早期快速診斷技術和流行病學檢測方法，已經在制定AI 診斷規(guī)程和防疫條例，并建立全國性的AI 檢測和預防網絡。
作者：余興明 電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn
