使用之前要讀說明書（中文說名書僅供參考請以英文為準(zhǔn)）
適用
本試劑盒適用于水產(chǎn)品中孔雀綠的定量檢測。
原理
本試劑盒原理是競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，利用萃取劑從樣品中提取到孔雀石綠. 在固相載體微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)和處理的樣品，然后加入孔雀石綠抗體，反應(yīng)30分洗孔，然后加入HRP標(biāo)記的孔雀石綠孵育30分后洗板，洗滌后加入顯色劑，結(jié)合的酶將無色的顯色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色；在450nm波長進(jìn)行檢測，樣品中的孔雀石綠濃度與吸收光強(qiáng)度成反比 。
特異性
與孔雀石綠類似物的交叉反應(yīng)
Compound %
CR
Malachite green 孔雀綠
100%
Leucomalachite 隱色孔雀綠
1%
Crystal Violet 結(jié)晶紫
120%
Leucocrystal Violet 隱色結(jié)晶紫
2%
檢測限
水產(chǎn)品: 0.5 ppb
試劑盒組成
96孔酶標(biāo)板：1塊（8×12條）。 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（Standard）: 1瓶（0.4ml/瓶），100ppb。
酶標(biāo)記物：1瓶（25倍, 0.8ml）HRP標(biāo)記的孔雀石綠結(jié)合物
孔雀石綠抗體：1瓶（9ml）
底物顯色液：1瓶（16ml）
終止液：1瓶（12ml 、1N HCl）。
結(jié)合物稀釋液：1瓶（15ml）。
樣本稀釋緩沖液：2瓶（25ml）
濃縮洗滌液：1瓶（5倍， 100ml/瓶）、酶標(biāo)板的洗滌。
使用說明書
注意
不要使用過了有效日期的孔雀石綠檢測試劑盒，不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用。不使用被污染和稀釋的試劑。使用前將所有的試劑拿到室溫（20℃-28℃），但不要超出24小時。孔雀石綠是抗生素應(yīng)小心對待。終止液為1M的鹽酸避免接觸皮膚，如果不小心滴到皮膚上要馬上用水清洗。洗液是5乘的在使用時要稀釋。

還需設(shè)備

去離子水或重蒸水

100ml或更大的量筒

樣品提取和采集用的玻璃器皿

甲醇

25、50、100 和250μL 單道或多道移液器

計時器

旋渦混合器

洗瓶

吸水紙

離心機(jī)

450nm 濾光片的酶標(biāo)儀
樣品制備(肉 1:20 稀釋)
1 魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品，稱取5g均質(zhì)好的樣品置于離心管中2 加入10 mL乙腈，振蕩器震蕩30分
3 4000g離心10分鐘
4 輕輕倒出上清, 移入到另一個離心管。
5 用3ml乙腈活化氧化鋁柱（1-2滴/秒）。
6 取3ml樣品過柱。
7 收集樣品于一干凈試管中。
8 加入3ml乙腈洗柱并收集與上述步驟7試管中。
9 利用樣品稀釋液1：10的比例稀釋洗脫物（50ul+450ul），待用。
第二種前處理方法： (1:10 稀釋)
1. 樣品均質(zhì)后稱取4g于離心管中；
2. 加入5ml 0.2MHCL，充分混合5min；室溫2000g離心5min
3. 吸取2.5ml上清液，加入5ml二氯甲烷 ，充分振蕩2分鐘；
4. 室溫2000g離心5min，去除上層液體；
5. 轉(zhuǎn)移2.5ml下層液體于另外一只玻璃試管中，50-60℃氮流蒸發(fā)；
6. 殘留物溶于2ml乙腈，搖勻；
7. 用樣品稀釋液將混合洗出液稀釋10倍（50ul乙腈提取液+450ul樣品稀釋液）；
8. 移取75ul進(jìn)行分析。
酶交聯(lián)物制備
試劑盒提供的酶交聯(lián)物是25倍的，每次使用前都要稀釋。
標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的制備
乙腈和樣品稀釋液1:9的比例混合使用
標(biāo)準(zhǔn)的制備
標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（ml）
標(biāo)準(zhǔn)品
1
4
40 uL
0.5
1
1.0ml 1ppb的標(biāo)準(zhǔn)液
0.1
1.8
0.2ml 1ppb的標(biāo)準(zhǔn)液
0.05
1
1ml 1ppb的標(biāo)準(zhǔn)液
0.025
0.5
0.5ml 0.05ppb的標(biāo)準(zhǔn)液
0.01
0.8
0.2ml 0.05ppb的標(biāo)準(zhǔn)液
0
1.000
0
操作步驟
1. 使
用前將試劑盒和樣品處理物提前從冰箱中拿出來使其達(dá)到室溫。裝有洗液的洗瓶。
2．從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。
3. 用移液器吸取75 μl 樣品處理物到對應(yīng)的測試孔 ，同時在每個孔中都加入75 μl 抗體溶液。
4. 輕輕震動30秒使其混勻孵育30分。
5. 孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震蕩洗滌后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板。拍板，去掉殘留的洗液。
6. 每個孔加入150 μL 酶標(biāo)結(jié)合物.
7. 輕輕震動30秒使其混勻孵育30分
8. 孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震蕩洗滌后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板。拍板，去掉殘留的洗液。
9. 每個孔加入150 μL 底物.孵育30分
10. 每孔加入 100 μL 終止液.
11. 450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）
結(jié)果分析
1．
半定量結(jié)果的判定，可根據(jù)樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值來判定，樣品的吸光度值低于某個標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說明樣品的孔雀石綠含量大于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度，樣品的吸光度值高于某個標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說明樣品的孔雀石綠含量小于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度。
2．
定量結(jié)果判定，需要以標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值為X軸，標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)為Y軸繪制曲線圖，將標(biāo)準(zhǔn)濃度吸光度值的點用直線連接，樣品的吸光度值也位于這條直線上，根據(jù)樣品的吸光度值在Y軸上即可找到相應(yīng)樣品的濃度，如果樣品的吸光度值大于最小標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值或小于最大標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，即可說明此樣品中孔雀石綠的含量小于0.01ppb或大于1ppb。
3. 當(dāng)樣品的濃度高于1ppb 時要調(diào)節(jié)稀釋倍數(shù)來獲得最終的濃度。