作者：田晶    作者單位：吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013

 

【摘要】  膜片鉗技術(shù)是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”，應(yīng)用該技術(shù)可以證實(shí)細(xì)胞膜上離子通道的存在，并能對(duì)其電生理特性、分子結(jié)構(gòu)、藥物作用機(jī)制等進(jìn)行深入的研究。

 

【關(guān)鍵詞】  膜片鉗技術(shù) 離子通道 進(jìn)展

    1976年由德國(guó)馬普生物物理化學(xué)研究所的Neher和Sakamann首次報(bào)道了應(yīng)用膜片鉗技術(shù)在蛙胸皮肌細(xì)胞膜上記錄到單通道電流^{［1］。}在以后的5 年中，膜片鉗技術(shù)不斷完善。自1981年以來，該技術(shù)已經(jīng)在不同動(dòng)物的肝、脾、胃腸、心肌、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌等各類細(xì)胞上應(yīng)用并取得了研究成果^［2］。膜片鉗技術(shù)點(diǎn)燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，與基因克隆技術(shù)(gene cloning)并駕齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。

 

    1  膜片鉗術(shù)的原理

 

      膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極（尖端直徑約1～5 μm）接觸細(xì)胞膜而不刺入，然后在微電極另一端開口施加適當(dāng)?shù)呢?fù)壓，將與電極尖端接觸的那一小片膜輕度吸人電極尖端的纖細(xì)開口，這樣在這小片膜周邊與微電極開口處的玻璃邊沿之間，會(huì)形成緊密的封接（gigaohm seal），在理想的情況下其電阻可達(dá)數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)千兆歐姆(l09Ω)以上的阻抗封接，使與電極尖開口處相連的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍的細(xì)胞膜 在電學(xué)上完全分隔，如果在這一小片膜中只包含了一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)通道蛋白質(zhì)分子，那么通過此微電極就可測(cè)出單一通道開放時(shí)的離子電流和電導(dǎo)，并能對(duì)單通道的其他功能特性進(jìn)行分析。

 

    2   膜片鉗主要技術(shù)操作

 

    2.1   實(shí)驗(yàn)所需儀器

 

    隨著計(jì)算機(jī)軟硬件技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了容數(shù)據(jù)記錄、采集、處理功能于一身的硬件軟件系統(tǒng)，簡(jiǎn)化了膜片鉗技術(shù)的操作及分析。實(shí)驗(yàn)儀器包括膜片鉗放大器，信號(hào)采集器，三維液壓操縱器，顯微鏡，給藥系統(tǒng)，細(xì)胞動(dòng)態(tài)呈像及攝像系統(tǒng)等。

 

    2.2  實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備

 

    膜片鉗實(shí)驗(yàn)采用的標(biāo)本可以是培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以是急性分離的細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞分離技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用，分離出的細(xì)胞可以基本滿足實(shí)驗(yàn)的要求，所以多用后者。不同實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)用從大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、羊、雪貂等動(dòng)物制作的細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行了大量的研究。近年也有學(xué)者在神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中用振動(dòng)切片將組織制成超薄 片作為標(biāo)本，這樣能保持神經(jīng)細(xì)胞在體發(fā)育的程序及空間結(jié)構(gòu)，有相對(duì)完整的突觸聯(lián)系。此外神經(jīng)元沒有受到消化酶的破壞，細(xì)胞生物活性接近生理狀態(tài)。而且，現(xiàn)在出現(xiàn)了雙探頭膜片鉗放大器可以做雙細(xì)胞記錄，觀察細(xì)胞間通道的動(dòng)態(tài)聯(lián)系^{［3］。}

 

    2.3  實(shí)驗(yàn)的一般操作步驟

 

    ①拉制微電極和充灌微電極；②將預(yù)先處理的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本置于顯微鏡載物臺(tái)上的灌流槽內(nèi)；③于顯微鏡低倍鏡下，用微操縱器將電極移動(dòng)到浴液上方，換用高倍鏡按一 定標(biāo)準(zhǔn)選擇合適的細(xì)胞，然后接近靶細(xì)胞或組織，完成電極與標(biāo)本的封接；④給予鉗位電壓或電流等指令條件并分別記錄電流、電壓等參數(shù)；⑤對(duì)電流等性質(zhì)分析后，施加不同的藥物記錄并分析電流等參數(shù)。

 

    2.4  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄與分析

 

    膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄的離子通道電流是一連串近似矩形的脈沖信號(hào)。在通道開放期間，信號(hào)的形態(tài)復(fù)雜多樣，有時(shí)是多個(gè)矩形波單位幅值簇狀發(fā)放（burst），有時(shí) 有短暫的間隔，時(shí)而有簇狀串（cluster）等，表示離子穿越通道的過程并非全部線性連續(xù)而富含非線性過程。通道的開放時(shí)程是隨機(jī)變化的指數(shù)形式分布。用指數(shù)和的分布，求取平均開放時(shí)間才能更精確地描述通道的活動(dòng)，往往需要成百上千個(gè)通道電流數(shù)據(jù)，這樣龐大的分析工作必須借助于計(jì)算機(jī)完成。

 

3  膜片鉗實(shí)驗(yàn)的常用工作模式

 

    3.1  細(xì)胞吸附式膜片

    細(xì)胞吸附式膜片（cell attached patch） 是膜片鉗的基本方式，其它方式由此衍生。這種膜片形式比較穩(wěn)定，因細(xì)胞骨架及有關(guān)代謝過程是完整的，故對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和環(huán)境干擾最小。但這種膜片形式易在電極尖端形成囊泡，從而細(xì)胞骨架可能有所變化。另外這種膜片不能控制細(xì)胞內(nèi)成分。且任何影響膜電位的處理均可影響其電位水平。

 

    3.2  內(nèi)面向外式膜片

 

    內(nèi)面向外式膜片（inside out patch）細(xì)胞內(nèi)外和電極內(nèi)的溶液均可調(diào)控，既能較容易地改變細(xì)胞內(nèi)的離子或物質(zhì)濃度，又能把酶等直接加于膜的內(nèi)側(cè)面，適宜研究胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)通道活動(dòng)的影響。但實(shí)驗(yàn)中難以改變膜外側(cè)物質(zhì)，且需浸于低鈣液中。常用于研究依賴細(xì)胞內(nèi)鈣的離子通道，如鈣敏感的鉀通道，還可用于細(xì)胞內(nèi)激素和第二信使與通道的調(diào)節(jié)作用。

 

    3.3  外面向外式膜片

 

    外面向外式膜片（outside out patch） 能接觸膜的兩側(cè)，可以任意改變膜外物質(zhì)的濃度，有利于研究離子、遞質(zhì)對(duì)膜外表面的作用，多用于研究細(xì)胞膜外側(cè)受體控制的離子通道。這些受體直接作用于離子通道，而不需經(jīng)過第二信使系統(tǒng)。因細(xì)胞外液容易更換，故加藥方便。缺陷是實(shí)驗(yàn)中難以改變胞內(nèi)成分，而且電極管內(nèi)必須充以低鈣液。

 

    3.4  全細(xì)胞式膜片

 

    全細(xì)胞式膜片（whole cell patch）方式使細(xì)胞內(nèi)與浴槽之間的漏流極少。電極本身阻抗（1～ 10 MΩ）與細(xì)胞封接后的阻抗相比較低，這種低接觸阻抗使單管電壓鉗容易實(shí)現(xiàn)。電極管內(nèi)與細(xì)胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細(xì)胞內(nèi)液的成分。細(xì)胞鉗記錄的是許多通道的平均電流，有利于綜合分析。如果有目的地將膜電位鉗制在某一程度，可做到選擇性抑制某些通道的活性而只記錄某種通道電流的總和，并可在同一 細(xì)胞上觀察幾種不同通道的情況。通過改變內(nèi)部介質(zhì)，如改變電極液成分，或在電極液中加入所需藥物，通過滲透很快改變胞漿成分并達(dá)到平衡，該手段在全細(xì)胞記錄中廣泛應(yīng)用。它適合于小細(xì)胞的電壓鉗位，對(duì)于直徑大于30 μm的細(xì)胞很難實(shí)現(xiàn)鉗位。不足之處是由于電極與細(xì)胞間交換快，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境很容易破壞，因此記錄所用的電極液應(yīng)與胞漿主要成分相同，如高K⁺，低Na⁺ 和Ca ²⁺及一定的緩沖成分和能量代謝所需的物質(zhì)。

 

    3.5  穿孔膜片

    穿孔膜片 (perforated patch)  是為克服常規(guī)全細(xì)胞模式的胞質(zhì)滲漏問題，有學(xué)者將與離子親和的制霉菌素或二性霉素B經(jīng)微電極灌流到含有類甾醇的細(xì)胞膜上，形成只允許一價(jià)離子通過的孔，用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道，借此對(duì)全細(xì)胞膜電流進(jìn)行記錄。由于此模式的胞質(zhì)滲漏極為緩慢，局部串聯(lián)阻抗較常規(guī)全細(xì)胞模式高，所以鉗制速度很慢，也稱為 緩慢全細(xì)胞模式。

 

    4  膜片鉗技術(shù)的主要用途

 

    膜片鉗技術(shù)廣泛用于研究細(xì)胞離子通道，已經(jīng)成為研究細(xì)胞水平生理功能的常用技術(shù)。歸納其主要用途包括^［4］ ：1）可分辨單通道電流，直接觀察通道開啟和關(guān) 閉的全過程。通過測(cè)得的單通道特征參數(shù)可鑒別通道類型，同時(shí)可驗(yàn)證和研究通道的開關(guān)動(dòng)力學(xué)模型。2）單通道記錄可以解釋某些藥物的作用機(jī)制，以研究特定藥 物對(duì)電壓和遞質(zhì)依賴通道的影響。3）膜片鉗的空間分辨率高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可分離細(xì)胞體與軸突和樹突的電流；在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中可深入了解受體的分布區(qū)域，繪制細(xì)胞表面的特定離子通道的分布圖。4）“內(nèi)面向外”和“外面向內(nèi)”膜片記錄允許任意改變膜片內(nèi)外溶液成分，分別研究單一組分對(duì)通道特征的影響，避免了其他成分的干擾。而全膜片記錄可用來研究常規(guī)電壓鉗無法研究的小型細(xì)胞，在控制細(xì)胞內(nèi)一定離子濃度的同時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)細(xì)胞膜的電活動(dòng)。這種方法已被用于采 用重組DNA技術(shù)表達(dá)的通道研究。5）膜片鉗技術(shù)還可用于研究第二信使的作用。

 

5  膜片鉗技術(shù)的擴(kuò)展應(yīng)用與展望

 

    膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合，使其應(yīng)用不斷擴(kuò)展。1991年Eberwine和Yeh 等首先將膜片鉗技術(shù)與PCR 技術(shù)結(jié)合起來運(yùn)用，其具體方法是：用全細(xì)胞膜片鉗記錄培養(yǎng)細(xì)胞或制備腦片的生物物理學(xué)和藥理學(xué)特征，然后將細(xì)胞胞漿內(nèi)容物收集入膜片微吸管尖內(nèi)，再把胞漿 RAN反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用PCR直接擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物通過凝膠電泳和DNA序列進(jìn)行分析。這兩項(xiàng)技術(shù)的結(jié)合可對(duì)形態(tài)相似、而電活動(dòng)不同的細(xì)胞做出分子水平的解釋^［5］ 。這樣在觀察電生理功能的同時(shí)，分析有關(guān)基因表達(dá)改變的情況，成功地實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)研究功能與分子的變化。

 

    通過克隆通道基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的方法，已能進(jìn)行通道分類并將與人類有關(guān)的通道基因克隆表達(dá)，如對(duì)KATP異源同構(gòu)的研究；并用膜片鉗記錄通道的動(dòng)力學(xué)特性， 增加了對(duì)通道結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)，例如發(fā)現(xiàn)病理和非病理狀態(tài)下，因通道基因表達(dá)的不同而有不同的電生理學(xué)特性。分子生物學(xué)的發(fā)現(xiàn)認(rèn)為通道的基因表達(dá)處于變化之中，不同狀態(tài)（如發(fā)育，疾�。�會(huì)帶來相應(yīng)的電變化或電重塑^［6］ 。

 

    膜片鉗技術(shù)結(jié)合Indo��1、Fluro��2和Fluro��3等熒光探針法測(cè)定胞內(nèi)鈣濃度，可研究鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣釋放的情況。用放射配體氚即3H結(jié)合技術(shù) 與膜片鉗技術(shù)結(jié)合，可以檢測(cè)異丙酚與通道的結(jié)合位點(diǎn)^［7］ 。另外，Nygren等^［8］ 和Priebe等^［9］ 用膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)學(xué)模型的方法描述人心房 和心室肌細(xì)胞通道特性，并可對(duì)特殊狀態(tài)下心肌的通道變化做出預(yù)測(cè)。

 

    總之膜片鉗技術(shù)以其實(shí)用、快速、靈敏、準(zhǔn)確及重復(fù)性好等技術(shù)優(yōu)勢(shì)已經(jīng)在大量的研究中得到證實(shí)。膜片鉗技術(shù)為從分子水平了解生物膜離子通道的門控動(dòng)力學(xué)特征及通透性、選擇性等膜信息，提供了最直接的手段，使人們對(duì)細(xì)胞膜通道功能的認(rèn)識(shí)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)結(jié)合必將繼續(xù)為生命科學(xué)的發(fā)展 做出巨大貢獻(xiàn)。

 

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