流式細胞儀的發(fā)展歷史及其原理與應用進展
魏熙胤 牛瑞芳(天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室 天津 300060)
摘 要 流式細胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytome-ter FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。它是眾多不同學術背景、不同科技領域相結合的結晶。它是物理學、生物學、醫(yī)學等綜合運用的產(chǎn)物。本文就流式細胞術的發(fā)展歷史、流式細胞儀的原理及在各領域的應用進行綜述,闡明現(xiàn)代流式細胞術由于結合單克隆抗體技術、定量熒光細胞化學技術,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發(fā)展。
關鍵詞 流式細胞術(FCM) 歷史 原理 應用
流式細胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytometer FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。它凝結眾多不同學術背景、不同科研領域科學家的心血。從流式細胞術的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個領域應用的拓展,每一步都是諸如電子技術、流體力學、計算機科學、激光技術、生物學、生物技術、高等數(shù)學、臨床醫(yī)學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結晶�，F(xiàn)代流式細胞術更是由于它結合單克隆抗體技術、定量細胞化學技術和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發(fā)展。流式細胞術的發(fā)展史也就是各個相關學科的發(fā)展史的縮影。
1 流式細胞術的發(fā)展歷史
1930 年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細胞的計數(shù);1934 年,Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人,他試圖用光電儀記錄流過1 根毛細管的細胞數(shù)量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術;1940 年,Coons 提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數(shù)器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV) 和可見光光譜區(qū)檢測細胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自動計數(shù)器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數(shù)器裝置,成為流式細胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計數(shù)器;1959 年,B 型Coulter計數(shù)器問世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個設想:(1) 用分光光度計定量細胞成分; (2) 結合測量值對細胞進行分類; 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎上提出細胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM(即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計;1972 年,Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術,為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎。現(xiàn)今隨著光電技術的進一步發(fā)展,流式細胞儀已開始向模塊化發(fā)展,即它的光學系統(tǒng)、檢測器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實驗要求隨意更換。進入21 世紀,流式細胞術已經(jīng)日臻完善,成為分析細胞學領域中無可替代的重要工具。
2 流式細胞儀的工作原理
流式細胞儀主要由4 部分組成:液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室,用不含細胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液) 在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動,形成一個圓形的流束(即鞘流) ,待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域,經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,稱為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號基本上反映細胞體積的大小;90°散射光又稱側(cè)向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號強度可反映細胞部分結構的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直,經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號,再通過模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機采集所測量到的各種信號進行計算處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上,以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同而有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達,其x 軸為測量的散射光或熒光的強度(可以是線性軸,也可以選擇對數(shù)軸) ,縱軸為相對細胞數(shù)。一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有256 或1024 通道數(shù),這視其模/數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的散點圖、等高線圖或三維的立體視圖等。流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取,它通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷,當帶電液滴通過電場,在電場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),然后落入相應的收集器之中,從而實現(xiàn)細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000 個/ s 提高到現(xiàn)在的25000 個/ s。
流式細胞術發(fā)展趨勢可歸納為:
①流式細胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應各種實際應用的便攜式、臺式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細胞儀;
②對流式細胞術檢測熒光參數(shù),從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時檢測15 種熒光信號;
③從檢測參數(shù)的相對定量發(fā)展為絕對定量;
④從檢測參數(shù)的手動人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動分析;
⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識地學習上述各門學科知識,只有這樣才能更好地將流式細胞術應用到生物醫(yī)學的臨床實踐和基礎科學研究工作中去。
3 流式細胞術的應用
流式細胞術的應用,簡單用一句話概括就是,凡能被熒光分子標記的細胞或微粒均能用流式細胞儀檢測。其中細胞生物學領域是流式細胞術在基礎研究中應用范圍最廣泛的領域,因為最初這個技術就是為此目的而設計的。
3.1 流式細胞術在細胞生物學中的應用
3.1.1
染色體核型分析 用流式細胞術可將分離的染色體進行分類、純化。傳統(tǒng)的核型分析在取材、培養(yǎng)、涂片、固定后,用分帶技術顯示出不同染色體的特征信息,然后再顯微照相,放大、剪接、組型。這是一個十分費時且不可避免摻有主觀因素的技術。目前,用儀器自動分型的方法,一是采用圖像技術的靜態(tài)方法,再有就是采用流式細胞術。后者除可做染色體分析外還可純化,得到克隆實驗所要求的染色體,這是其他任何技術都無法完成的,為此設計專門的特種流式細胞計。
3.1.2
在分子遺傳學領域中的應用 流式細胞術的分析功能和分選功能在分子遺傳學領域很有用處。分析的功能常用來研究分離的染色體,有時也用來檢測或定量測量細胞表面或內(nèi)部為特異基因所編碼的細胞分子;分選的功能可用來分選指定的染色體,然后用來建立人類染色體DNA 文庫。
3.1.3
用于家畜性別的預選擇 將家畜的X、Y精子分選出來,達到控制胎畜性別的目的。此外,在精子發(fā)生學、睪丸瘤、不育癥、藥物對精細胞的干擾等研究中,都可使用流式細胞術進行定量研究。
3.1.4
在微生物學中的應用 流式細胞技術在真核細胞生物學方面,特別是哺乳類細胞學方面有重要貢獻,在微生物學方面的應用則發(fā)展相對較晚。實際上,微生物學,尤其是細菌學當前面臨的一些問題,特別是需要對大數(shù)量細菌進行逐個的快速多參數(shù)精確測量時,流式細胞術很適合解決此類問題。已發(fā)表的論文多數(shù)是針對酵母菌和各類細菌的測量與分析。酵母菌的測量在技術上比較簡單,它自身體積大,其DNA 含量約為人類二倍體細胞DNA 含量的1/ 200。已用定量DNA、RNA 和光散射方法研究酵母菌的細胞周期。用同樣方法和目的,也對原生生物、藻類和霉菌類以及各種重金屬對其的影響進行研究。另外用FITC 結合的抗血清可作種系鑒別,應用此項技術已能代替臨床上經(jīng)典的費時繁瑣的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。在工業(yè)中,流式細胞術可用于快速微生物鑒定,如對飲用水及原油中的微生物學鑒定與控制。
3.1.5 在細胞周期研究中的應用 在生物細胞核中,DNA 含量并非恒定,隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。G0 期是第一次細胞分裂完成后進入第二次分裂開始前的階段。G0 期細胞是不參與細胞增殖的一群細胞,為靜止期細胞,其細胞DNA 含量為較恒定的二倍體(diploid) 。G1 期指第二次分裂開始到本次DNA 復制之前的過程,此期主要功能是積累能量和原料為DNA 的復制做準備,故又稱DNA 合成前期。G1 期細胞具有增殖活性,開始有RNA 的合成;G0 期和Gl 期是細胞處于周期過程中兩種不同功能狀態(tài)時相的細胞,不能視為同一細胞,但就DNA 含量而言,兩者相同,均為二倍體DNA 含量。S 期又稱DNA 合成期,合成及復制DNA。當細胞進入S 期后,DNA 含量值逐漸從二倍體～四倍體增加,直到細胞DNA 倍增結束,進入G2 期。G2 期指從DNA 復制完成到有絲分裂開始的時間區(qū)間,又稱DNA 合成后期或有絲分裂前期,此期合成大量蛋白質(zhì),為M期的細胞分裂做準備。經(jīng)過G2 期后細胞最終進入M期,即有絲分裂期。在M期分裂為兩個子細胞之前,G2 期和M期的DNA 含量均為恒定的四倍體細胞群。FCM分析細胞周期與DNA 倍體時,需對DNA進行染色。DNA 熒光染料與細胞DNA 雙鏈的結合有一定量效關系,即DNA 含量的多少與PI 結合量成正比,因此通過熒光強度可以反映細胞內(nèi)DNA 的含量。
3.2 流式細胞術在醫(yī)學中的應用
3.2.1
在免疫學中的應用 隨著單克隆抗體技術、熒光色素化學等技術的發(fā)展,流式細胞術成為當代新技術的“雜交體”。正像免疫學作為一種不斷發(fā)展的學科和技術手段延伸到生物、醫(yī)學及其他領域一樣,流式細胞術也以它的快速、靈活和定量的特點,廣泛地被應用于免疫理論研究和臨床實踐應用的各方面,所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術基石之一。尤其同單克隆抗體結合應用,在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)督、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面都起著相當重要的作用。隨著細胞學、病理學、免疫學、腫瘤學研究發(fā)展的需要、流式細胞測定技術也不斷得到充實和完善。它不僅在功能上作為熒光顯微鏡的補充,而且因具備二者的全部功能和特點,從而在免疫及有關各學科領域發(fā)揮出更重要的作用。
20 世紀80 年代中期,國際上提出的白血病MIC分型法,標志著流式細胞儀及免疫分型在白血病診斷中的廣泛應用。我國自80 年代中期引進該儀器,90 年代迅速發(fā)展,現(xiàn)在已得到普遍應用。這期間免疫標記方法已發(fā)生很大的變化,由開始的主要采用間接免疫熒光標記法到直接免疫熒光標記法,從單色或雙色到利用CD45 抗體標記設門法進行多色免疫標記,使免疫分型的準確性得到很大的提高,現(xiàn)在已成為診斷白血病不可缺少的工具。同時淋巴瘤的免疫分型與白血病免疫分型一樣也已得到廣泛開展。在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中FCM也發(fā)揮極大的作用。它通過對外周血中的CD4 + T 淋巴細胞進行絕對記數(shù),來反映病情進展及監(jiān)測療效。
3.2.2 流式細胞術在腫瘤學上的應用 利用FCM進行細胞周期分析、DNA
倍體分析、定量分析檢測細胞增殖標志物、細胞表面標志、癌基因蛋白產(chǎn)物、耐藥蛋白、細胞凋亡等,從而獲得組織形態(tài)學方法難以得到的信息,可為腫瘤的臨床診斷、治療和預防提供幫助。對腫瘤細胞DNA
含量作定量分析,解析細胞周期,通過細胞異倍體測定預測各種腫瘤的預后,并能在化療中對藥物的選擇和放療中強度、時間的決定等起指導作用。解析抗癌藥物作用機制,對癌癥進行早期診斷及鑒別良惡性有一定參考價值。此外,由于FCM對凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也發(fā)揮著重要作用,近年來引起腫瘤研究者的極大關注,已廣泛應用于腫瘤基礎和臨床研究中,為腫瘤診斷、療效評價和預后預測提供重要參考指標。另外,傳統(tǒng)的細胞形態(tài)學至今仍是診斷腫瘤的一種重要的手段。多年來,細胞學工作者就設想使腫瘤細胞學診斷自動化,流式細胞術的問世,使細胞學檢查自動化的宿愿如愿以償,并已廣泛應用于腫瘤臨床細胞學的診斷研究。
大量的臨床應用表明,流式細胞術對腫瘤細胞學的診斷正確率已達常規(guī)細胞學診斷水平。腫瘤細胞對化療藥物的耐受性是腫瘤治療的主要障礙。腫瘤細胞的耐藥性可分為原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥,前者在化療前就存在于腫瘤細胞中,與用藥無關,后者是由化療藥物誘導產(chǎn)生的,即在藥物使用前對藥物敏感,而在用藥之后產(chǎn)生耐藥。繼發(fā)耐藥根據(jù)耐藥譜的不同又可分為原藥耐藥(PDR) 和多藥耐藥(MDR) 。MDR 相關蛋白包括P 糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等。它們都屬于ATP 酶活性轉(zhuǎn)運蛋白,均是通過藥物外排泵的作用降低細胞中藥物的聚集。因此應用FCM 檢測腫瘤細胞的多藥耐藥相關蛋白的表達水平,對監(jiān)測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定意義。
3.2.3
在血液學研究中的應用 除上述FCM在白血病及淋巴瘤的免疫分型應用之外,它在血液學研究中有廣泛的用途。如血小板記數(shù)、血小板自身抗體測定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析等。紅細胞表面相關免疫球蛋白測定、紅細胞血型抗原分析等。
3.3 流式細胞術新技術的應用
3.3.1
液相芯片技術 生物芯片技術是近年來隨著人類基因組計劃和蛋白質(zhì)組計劃的進展在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項新技術,現(xiàn)已被大家所熟知。將生物芯片技術和FCM有機結合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等)
標記在各種有熒光的微球上,以熒光標記微球作為反應載體在液相系統(tǒng)中完成生物學反應,即為流式細胞術液相芯片技術。它組成由微球體+ 探針+ 目的分子+ 報告分子的一種簡單反應模式�？梢栽谕灰合嘀型瑫r檢測多個目的分子。如對血液中多種白細胞介素檢測。
3.3.2 定量流式細胞分析 定量流式細胞分析(quantitative flow cytometry QFCM)
是指用流式細胞術對細胞或微粒上標記熒光分子的定量分析,從而對細胞的生物分子進行精確測量。如每個分子表達的平均分子數(shù)、抗原數(shù)等。定量流式細胞分析不同于以往的相對熒光強度或陽性細胞百分率測量,它更為準確、靈敏。為FCM的發(fā)展趨勢。如在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中,對外周血中的CD4 + T 淋巴細胞進行絕對記數(shù),來反映病情進展及監(jiān)測療效�？傊�,流式細胞術應用極為廣泛,本文所介紹的也只是其中一部分。隨著當今各項科學技術的迅猛發(fā)展,流式細胞術會有更加廣闊的應用前景。
參考文獻
1 馬文新等1 尿液有形成分的分析及儀器,世界醫(yī)療器械雜志,1997 ,3(9) :62
2 王建中1 加強臨床流式細胞免疫表型分析的質(zhì)量控制,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :5～7
3 Taylor JD ,Briley D1et al1Flow cytometric platform for high-throughput singlenucleotide polymorphism analysis1Bio Tech-niques12001 ,30 :611～669
4 Spain M,Mcdade R1A workstation approach to bioassays1IVD Technol1 2000 ,6 :35～42
5 北京臨床流式細胞分析協(xié)作組1 流式細胞術三色分析調(diào)查成人外周血CD34 + 造血干細胞絕對記數(shù)參考范圍,中華檢驗醫(yī)學雜志,2002 ,25 :58～60
6 王建中。 臨床流式細胞分析,上海: 上海科技出版社,2005
7 北京臨床流式細胞分析協(xié)作組. 流式細胞儀單平臺技術調(diào)查成人外周血T 淋巴細胞亞群絕對記數(shù)參考范圍,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :123～125
8 Vermes I , Haanen C , Reutelingsperger C1 Flow cytometeru of apoptotic cdll death1 J Immunol Methods ,2000 ,243 :167
9 譚曉華等1PI 染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的影響因素,第一軍醫(yī)大學學報,2000 ,20 :344
10 王建中等1 三種流式術記數(shù)血小板方法的比較研究,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :8～12
11 王書奎,周振英1 實用流式細胞術彩色圖譜,上海:第二軍醫(yī)大學出版社,2004
12 趙武述1 細胞因子研究的臨床意義及展望,中華檢驗醫(yī)學雜志,2002 ,23 :199
13 宋平根等1 流式細胞術的原理和應用,北京:北京師范大學出版社,1992
14 Maecker HT1Cytokine flow cytometry Methods Mol Biol 2004 ,263 :95～108
15 王建中1 流式細胞術分析血液淋巴細胞免疫表型方法學研究,中華檢驗醫(yī)學雜志,2000 ,23 :203～207
摘 要 流式細胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytome-ter FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。它是眾多不同學術背景、不同科技領域相結合的結晶。它是物理學、生物學、醫(yī)學等綜合運用的產(chǎn)物。本文就流式細胞術的發(fā)展歷史、流式細胞儀的原理及在各領域的應用進行綜述,闡明現(xiàn)代流式細胞術由于結合單克隆抗體技術、定量熒光細胞化學技術,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發(fā)展。
關鍵詞 流式細胞術(FCM) 歷史 原理 應用
流式細胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytometer FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術。它凝結眾多不同學術背景、不同科研領域科學家的心血。從流式細胞術的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個領域應用的拓展,每一步都是諸如電子技術、流體力學、計算機科學、激光技術、生物學、生物技術、高等數(shù)學、臨床醫(yī)學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結晶�，F(xiàn)代流式細胞術更是由于它結合單克隆抗體技術、定量細胞化學技術和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發(fā)展。流式細胞術的發(fā)展史也就是各個相關學科的發(fā)展史的縮影。
1 流式細胞術的發(fā)展歷史
1930 年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細胞的計數(shù);1934 年,Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人,他試圖用光電儀記錄流過1 根毛細管的細胞數(shù)量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術;1940 年,Coons 提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數(shù)器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV) 和可見光光譜區(qū)檢測細胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自動計數(shù)器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數(shù)器裝置,成為流式細胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計數(shù)器;1959 年,B 型Coulter計數(shù)器問世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個設想:(1) 用分光光度計定量細胞成分; (2) 結合測量值對細胞進行分類; 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎上提出細胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM(即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計;1972 年,Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型,能夠檢測出經(jīng)熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術,為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎。現(xiàn)今隨著光電技術的進一步發(fā)展,流式細胞儀已開始向模塊化發(fā)展,即它的光學系統(tǒng)、檢測器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實驗要求隨意更換。進入21 世紀,流式細胞術已經(jīng)日臻完善,成為分析細胞學領域中無可替代的重要工具。
2 流式細胞儀的工作原理
流式細胞儀主要由4 部分組成:液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室,用不含細胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液) 在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動,形成一個圓形的流束(即鞘流) ,待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域,經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,稱為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號基本上反映細胞體積的大小;90°散射光又稱側(cè)向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號強度可反映細胞部分結構的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直,經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號,再通過模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機采集所測量到的各種信號進行計算處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上,以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同而有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達,其x 軸為測量的散射光或熒光的強度(可以是線性軸,也可以選擇對數(shù)軸) ,縱軸為相對細胞數(shù)。一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有256 或1024 通道數(shù),這視其模/數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的散點圖、等高線圖或三維的立體視圖等。流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取,它通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷,當帶電液滴通過電場,在電場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),然后落入相應的收集器之中,從而實現(xiàn)細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000 個/ s 提高到現(xiàn)在的25000 個/ s。
流式細胞術發(fā)展趨勢可歸納為:
①流式細胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應各種實際應用的便攜式、臺式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細胞儀;
②對流式細胞術檢測熒光參數(shù),從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時檢測15 種熒光信號;
③從檢測參數(shù)的相對定量發(fā)展為絕對定量;
④從檢測參數(shù)的手動人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動分析;
⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識地學習上述各門學科知識,只有這樣才能更好地將流式細胞術應用到生物醫(yī)學的臨床實踐和基礎科學研究工作中去。
3 流式細胞術的應用
流式細胞術的應用,簡單用一句話概括就是,凡能被熒光分子標記的細胞或微粒均能用流式細胞儀檢測。其中細胞生物學領域是流式細胞術在基礎研究中應用范圍最廣泛的領域,因為最初這個技術就是為此目的而設計的。
3.1 流式細胞術在細胞生物學中的應用
3.1.1
染色體核型分析 用流式細胞術可將分離的染色體進行分類、純化。傳統(tǒng)的核型分析在取材、培養(yǎng)、涂片、固定后,用分帶技術顯示出不同染色體的特征信息,然后再顯微照相,放大、剪接、組型。這是一個十分費時且不可避免摻有主觀因素的技術。目前,用儀器自動分型的方法,一是采用圖像技術的靜態(tài)方法,再有就是采用流式細胞術。后者除可做染色體分析外還可純化,得到克隆實驗所要求的染色體,這是其他任何技術都無法完成的,為此設計專門的特種流式細胞計。
3.1.2
在分子遺傳學領域中的應用 流式細胞術的分析功能和分選功能在分子遺傳學領域很有用處。分析的功能常用來研究分離的染色體,有時也用來檢測或定量測量細胞表面或內(nèi)部為特異基因所編碼的細胞分子;分選的功能可用來分選指定的染色體,然后用來建立人類染色體DNA 文庫。
3.1.3
用于家畜性別的預選擇 將家畜的X、Y精子分選出來,達到控制胎畜性別的目的。此外,在精子發(fā)生學、睪丸瘤、不育癥、藥物對精細胞的干擾等研究中,都可使用流式細胞術進行定量研究。
3.1.4
在微生物學中的應用 流式細胞技術在真核細胞生物學方面,特別是哺乳類細胞學方面有重要貢獻,在微生物學方面的應用則發(fā)展相對較晚。實際上,微生物學,尤其是細菌學當前面臨的一些問題,特別是需要對大數(shù)量細菌進行逐個的快速多參數(shù)精確測量時,流式細胞術很適合解決此類問題。已發(fā)表的論文多數(shù)是針對酵母菌和各類細菌的測量與分析。酵母菌的測量在技術上比較簡單,它自身體積大,其DNA 含量約為人類二倍體細胞DNA 含量的1/ 200。已用定量DNA、RNA 和光散射方法研究酵母菌的細胞周期。用同樣方法和目的,也對原生生物、藻類和霉菌類以及各種重金屬對其的影響進行研究。另外用FITC 結合的抗血清可作種系鑒別,應用此項技術已能代替臨床上經(jīng)典的費時繁瑣的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。在工業(yè)中,流式細胞術可用于快速微生物鑒定,如對飲用水及原油中的微生物學鑒定與控制。
3.1.5 在細胞周期研究中的應用 在生物細胞核中,DNA 含量并非恒定,隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。G0 期是第一次細胞分裂完成后進入第二次分裂開始前的階段。G0 期細胞是不參與細胞增殖的一群細胞,為靜止期細胞,其細胞DNA 含量為較恒定的二倍體(diploid) 。G1 期指第二次分裂開始到本次DNA 復制之前的過程,此期主要功能是積累能量和原料為DNA 的復制做準備,故又稱DNA 合成前期。G1 期細胞具有增殖活性,開始有RNA 的合成;G0 期和Gl 期是細胞處于周期過程中兩種不同功能狀態(tài)時相的細胞,不能視為同一細胞,但就DNA 含量而言,兩者相同,均為二倍體DNA 含量。S 期又稱DNA 合成期,合成及復制DNA。當細胞進入S 期后,DNA 含量值逐漸從二倍體～四倍體增加,直到細胞DNA 倍增結束,進入G2 期。G2 期指從DNA 復制完成到有絲分裂開始的時間區(qū)間,又稱DNA 合成后期或有絲分裂前期,此期合成大量蛋白質(zhì),為M期的細胞分裂做準備。經(jīng)過G2 期后細胞最終進入M期,即有絲分裂期。在M期分裂為兩個子細胞之前,G2 期和M期的DNA 含量均為恒定的四倍體細胞群。FCM分析細胞周期與DNA 倍體時,需對DNA進行染色。DNA 熒光染料與細胞DNA 雙鏈的結合有一定量效關系,即DNA 含量的多少與PI 結合量成正比,因此通過熒光強度可以反映細胞內(nèi)DNA 的含量。
3.2 流式細胞術在醫(yī)學中的應用
3.2.1
在免疫學中的應用 隨著單克隆抗體技術、熒光色素化學等技術的發(fā)展,流式細胞術成為當代新技術的“雜交體”。正像免疫學作為一種不斷發(fā)展的學科和技術手段延伸到生物、醫(yī)學及其他領域一樣,流式細胞術也以它的快速、靈活和定量的特點,廣泛地被應用于免疫理論研究和臨床實踐應用的各方面,所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術基石之一。尤其同單克隆抗體結合應用,在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)督、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面都起著相當重要的作用。隨著細胞學、病理學、免疫學、腫瘤學研究發(fā)展的需要、流式細胞測定技術也不斷得到充實和完善。它不僅在功能上作為熒光顯微鏡的補充,而且因具備二者的全部功能和特點,從而在免疫及有關各學科領域發(fā)揮出更重要的作用。
20 世紀80 年代中期,國際上提出的白血病MIC分型法,標志著流式細胞儀及免疫分型在白血病診斷中的廣泛應用。我國自80 年代中期引進該儀器,90 年代迅速發(fā)展,現(xiàn)在已得到普遍應用。這期間免疫標記方法已發(fā)生很大的變化,由開始的主要采用間接免疫熒光標記法到直接免疫熒光標記法,從單色或雙色到利用CD45 抗體標記設門法進行多色免疫標記,使免疫分型的準確性得到很大的提高,現(xiàn)在已成為診斷白血病不可缺少的工具。同時淋巴瘤的免疫分型與白血病免疫分型一樣也已得到廣泛開展。在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中FCM也發(fā)揮極大的作用。它通過對外周血中的CD4 + T 淋巴細胞進行絕對記數(shù),來反映病情進展及監(jiān)測療效。
3.2.2 流式細胞術在腫瘤學上的應用 利用FCM進行細胞周期分析、DNA
倍體分析、定量分析檢測細胞增殖標志物、細胞表面標志、癌基因蛋白產(chǎn)物、耐藥蛋白、細胞凋亡等,從而獲得組織形態(tài)學方法難以得到的信息,可為腫瘤的臨床診斷、治療和預防提供幫助。對腫瘤細胞DNA
含量作定量分析,解析細胞周期,通過細胞異倍體測定預測各種腫瘤的預后,并能在化療中對藥物的選擇和放療中強度、時間的決定等起指導作用。解析抗癌藥物作用機制,對癌癥進行早期診斷及鑒別良惡性有一定參考價值。此外,由于FCM對凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也發(fā)揮著重要作用,近年來引起腫瘤研究者的極大關注,已廣泛應用于腫瘤基礎和臨床研究中,為腫瘤診斷、療效評價和預后預測提供重要參考指標。另外,傳統(tǒng)的細胞形態(tài)學至今仍是診斷腫瘤的一種重要的手段。多年來,細胞學工作者就設想使腫瘤細胞學診斷自動化,流式細胞術的問世,使細胞學檢查自動化的宿愿如愿以償,并已廣泛應用于腫瘤臨床細胞學的診斷研究。
大量的臨床應用表明,流式細胞術對腫瘤細胞學的診斷正確率已達常規(guī)細胞學診斷水平。腫瘤細胞對化療藥物的耐受性是腫瘤治療的主要障礙。腫瘤細胞的耐藥性可分為原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥,前者在化療前就存在于腫瘤細胞中,與用藥無關,后者是由化療藥物誘導產(chǎn)生的,即在藥物使用前對藥物敏感,而在用藥之后產(chǎn)生耐藥。繼發(fā)耐藥根據(jù)耐藥譜的不同又可分為原藥耐藥(PDR) 和多藥耐藥(MDR) 。MDR 相關蛋白包括P 糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等。它們都屬于ATP 酶活性轉(zhuǎn)運蛋白,均是通過藥物外排泵的作用降低細胞中藥物的聚集。因此應用FCM 檢測腫瘤細胞的多藥耐藥相關蛋白的表達水平,對監(jiān)測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定意義。
3.2.3
在血液學研究中的應用 除上述FCM在白血病及淋巴瘤的免疫分型應用之外,它在血液學研究中有廣泛的用途。如血小板記數(shù)、血小板自身抗體測定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析等。紅細胞表面相關免疫球蛋白測定、紅細胞血型抗原分析等。
3.3 流式細胞術新技術的應用
3.3.1
液相芯片技術 生物芯片技術是近年來隨著人類基因組計劃和蛋白質(zhì)組計劃的進展在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項新技術,現(xiàn)已被大家所熟知。將生物芯片技術和FCM有機結合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等)
標記在各種有熒光的微球上,以熒光標記微球作為反應載體在液相系統(tǒng)中完成生物學反應,即為流式細胞術液相芯片技術。它組成由微球體+ 探針+ 目的分子+ 報告分子的一種簡單反應模式�？梢栽谕灰合嘀型瑫r檢測多個目的分子。如對血液中多種白細胞介素檢測。
3.3.2 定量流式細胞分析 定量流式細胞分析(quantitative flow cytometry QFCM)
是指用流式細胞術對細胞或微粒上標記熒光分子的定量分析,從而對細胞的生物分子進行精確測量。如每個分子表達的平均分子數(shù)、抗原數(shù)等。定量流式細胞分析不同于以往的相對熒光強度或陽性細胞百分率測量,它更為準確、靈敏。為FCM的發(fā)展趨勢。如在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治療中,對外周血中的CD4 + T 淋巴細胞進行絕對記數(shù),來反映病情進展及監(jiān)測療效�？傊�,流式細胞術應用極為廣泛,本文所介紹的也只是其中一部分。隨著當今各項科學技術的迅猛發(fā)展,流式細胞術會有更加廣闊的應用前景。
參考文獻
1 馬文新等1 尿液有形成分的分析及儀器,世界醫(yī)療器械雜志,1997 ,3(9) :62
2 王建中1 加強臨床流式細胞免疫表型分析的質(zhì)量控制,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :5～7
3 Taylor JD ,Briley D1et al1Flow cytometric platform for high-throughput singlenucleotide polymorphism analysis1Bio Tech-niques12001 ,30 :611～669
4 Spain M,Mcdade R1A workstation approach to bioassays1IVD Technol1 2000 ,6 :35～42
5 北京臨床流式細胞分析協(xié)作組1 流式細胞術三色分析調(diào)查成人外周血CD34 + 造血干細胞絕對記數(shù)參考范圍,中華檢驗醫(yī)學雜志,2002 ,25 :58～60
6 王建中。 臨床流式細胞分析,上海: 上海科技出版社,2005
7 北京臨床流式細胞分析協(xié)作組. 流式細胞儀單平臺技術調(diào)查成人外周血T 淋巴細胞亞群絕對記數(shù)參考范圍,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :123～125
8 Vermes I , Haanen C , Reutelingsperger C1 Flow cytometeru of apoptotic cdll death1 J Immunol Methods ,2000 ,243 :167
9 譚曉華等1PI 染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的影響因素,第一軍醫(yī)大學學報,2000 ,20 :344
10 王建中等1 三種流式術記數(shù)血小板方法的比較研究,中華檢驗醫(yī)學雜志,2003 ,26 :8～12
11 王書奎,周振英1 實用流式細胞術彩色圖譜,上海:第二軍醫(yī)大學出版社,2004
12 趙武述1 細胞因子研究的臨床意義及展望,中華檢驗醫(yī)學雜志,2002 ,23 :199
13 宋平根等1 流式細胞術的原理和應用,北京:北京師范大學出版社,1992
14 Maecker HT1Cytokine flow cytometry Methods Mol Biol 2004 ,263 :95～108
15 王建中1 流式細胞術分析血液淋巴細胞免疫表型方法學研究,中華檢驗醫(yī)學雜志,2000 ,23 :203～207
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com