一個(gè)電生理配置有4個(gè)主要的需求:
環(huán)境需求:保持標(biāo)本的健康的手段。
光學(xué)需求:顯現(xiàn)標(biāo)本以供觀察的手段。
機(jī)械結(jié)構(gòu)需求:穩(wěn)定定位微電極的手段。
電子學(xué)需求:放大和測(cè)量信號(hào)的手段。
我們將配置分成兩種類型的“典型”配置:胞外記錄和單通道膜片鉗記錄。
胞外記錄的配置
該配置主要用于記錄腦片的場(chǎng)電位。一般目標(biāo)是將一個(gè)相對(duì)粗糙的電極放置在組織的胞外空間,同時(shí)盡可能模仿體內(nèi)的組織環(huán)境。因此,需要一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的小空腔,用來(lái)對(duì)組織進(jìn)行溫暖、氧化、灌注。而另一方面,光學(xué)和機(jī)械結(jié)構(gòu)需求則簡(jiǎn)單得多。一個(gè)解剖用顯微鏡,至少15cm的工作距離(配合近似垂直放置的微操縱器),通常已經(jīng)可以看到切片或大體的形態(tài)學(xué)特征。由于對(duì)定位時(shí)手的震動(dòng)和電極的精確放置都沒(méi)有苛刻要求,微操縱器可以選用相對(duì)粗糙的機(jī)械類型。但是,在記錄過(guò)程中,微操縱器不允許有一點(diǎn)漂移和震動(dòng)。
需要使用低噪聲的電壓放大器。由于信號(hào)的范圍可能在10 uV 到10 mV 范圍內(nèi),低噪聲電壓放大器的增益至少要達(dá)到1000。
單通道膜片鉗記錄配置
標(biāo)準(zhǔn)的膜片鉗配置在許多方面與胞外記錄恰好顛倒過(guò)來(lái)了。由于對(duì)環(huán)境的控制非常少,實(shí)驗(yàn)通常在室溫下、一個(gè)無(wú)灌注的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。
光學(xué)和機(jī)械需求則根據(jù)實(shí)際的細(xì)胞的大小(10或20 um)有特殊的規(guī)定。顯微鏡應(yīng)該有放大300或400倍的能力,并需要某種對(duì)照增強(qiáng)能力(Nomarski, Phase or Hoffman)。omarski(微分干涉)對(duì)于電極的精確放置是最好的,因?yàn)樗挠跋褚蕾囉谝曇耙粋(gè)很窄的深度上,這有助于精確定位(定位不好,影像是模糊的)。Phase(相差法)用于精確定位程度要求低一些的場(chǎng)合,但提供了更好的對(duì)比度。Hoffman方法提供了較便宜的,稍微退化點(diǎn)的Nomarski版本。
最好使用倒置顯微鏡:
(1) 這樣能使電極頂端更容易被看到,因?yàn)槲镧R在chamber的下方,
(2) 提供了更大更堅(jiān)固的平臺(tái),用來(lái)固定微操縱器。
微操縱器應(yīng)提供良好的,平滑的移動(dòng)(最多每秒2um)。對(duì)震動(dòng)和穩(wěn)定性的需求決定于記錄模式:是希望記錄cell-attached- patch,還是cell-free (inside-out or outside-out) patch。
在cell-free- patch中,微操縱器只需要在形成封接過(guò)程中保持穩(wěn)定,一旦離開(kāi)了細(xì)胞,穩(wěn)定就不是那么至關(guān)重要了。這通常不到一分鐘。
單通道記錄的放大器比胞外記錄使用的要復(fù)雜得多。象Heka公司的EPC9,EPC10以及Axon公司的Axopatch200B都是非常優(yōu)秀的膜片鉗放大器。
組織切片膜片鉗記錄配置
膜片鉗技術(shù)的近來(lái)擴(kuò)展,切片膜片鉗技術(shù),其配置需要是體外胞外記錄和常規(guī)膜片鉗配置的一個(gè)組合。例如,該技術(shù)可能需要一個(gè)chamber,需要連續(xù)對(duì)切片進(jìn)行灌流和供氧。大部分的其他要求,與常規(guī)膜片鉗類似。光學(xué)需求與切片的厚度有關(guān)(thick-slice or thin-slice),對(duì)thick-slice,簡(jiǎn)單的解剖顯微鏡就夠了;而對(duì)thin-slice,顯微鏡則需要提供400倍的放大,良好的頂端聚焦和對(duì)照增強(qiáng)。
設(shè)備放置:
電生理實(shí)驗(yàn)人員傾向于在小房間的一角獨(dú)自工作。小房間通常比較安靜,震動(dòng)和空氣流動(dòng)被削減了。
首先放置顯微鏡是比較明智的,然后是密切聯(lián)系的附件,例如chamber,微操縱器和溫度控制系統(tǒng)(如果安裝了)。基本原則是第一要保證細(xì)胞恰當(dāng)?shù)奶幱陟o止?fàn)顟B(tài),第二要確認(rèn)從細(xì)胞記錄信息的行為沒(méi)有對(duì)細(xì)胞帶來(lái)連續(xù)的致命傷害。
第一原則可以通過(guò)良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境幫助實(shí)現(xiàn),第二原則通過(guò)良好的光學(xué)和機(jī)械手段實(shí)現(xiàn)。
在顯微鏡周圍工作,保持例如灌注閥門和微操縱器的控制要非常謹(jǐn)慎,避免震動(dòng)。理想的情況是,它們放置在一個(gè)小架子上,該架子從防震臺(tái)延伸出來(lái),保證在通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí),不會(huì)產(chǎn)生破壞的震動(dòng)。
選擇和放置電子儀器是個(gè)人偏好的事情。最低的要求是只有一個(gè)放大器和一臺(tái)計(jì)算機(jī),另外強(qiáng)調(diào)最好放置在一個(gè)儀器架上。一個(gè)示波器是重要的,因?yàn),?jì)算機(jī)通常不夠靈活;而且,示波器常能展現(xiàn)在計(jì)算機(jī)屏幕上看不到的一些意外情況,例如計(jì)算機(jī)的采樣率設(shè)置不合適時(shí),就會(huì)丟失大量細(xì)節(jié)信息,而示波器則不會(huì)。
示波器應(yīng)與眼睛水平,在示波器上面或下面直接放置微電極放大器,以便容易的調(diào)整和監(jiān)視信號(hào)。
最后,計(jì)算機(jī)應(yīng)放置得盡可能遠(yuǎn),但離顯微鏡還是應(yīng)該保持在手臂來(lái)回夠得著的地方。這有助于削減顯示器的輻射噪聲,也能確保在使用鍵盤匆忙記錄時(shí)不至于肘部撞擊顯微鏡。
最后一般的建議,也許是最難注意的是:抵制十全十美的配置誘惑,只要有一半的可能性,就開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。