動物活體成像之熒光成像的基本原理、應用領域及常見實驗技巧
熒光成像的實驗步驟
● 用熒光報告基團/熒光染料進行標記（注射入小鼠體內）。
● 小鼠經(jīng)過麻醉后放入成像暗箱平臺，照明燈拍攝第一次背景。
● 照明燈自動關閉，動物成像。
常用熒光染料：DIR、DID、CY5、CY5.5
活體動物熒光成像標記的分類
熒光成像基礎
1. 熒光基團（fluorophores）
熒光基團是一類能吸收特定波長的光并發(fā)出熒光的分子或分子部分。它們是熒光染料、熒光蛋白和熒光探針等熒光物質的核心組成部分。
2. 熒光染料（fluorescent dyes）
熒光染料是一類具有熒光性質的有機化合物。熒光染料通常由以下部分組成：
熒光基團：吸收光能并發(fā)出熒光的分子部分，通常具有共軛體系。
連接基團：連接熒光基團和靶分子的分子部分。
3. 熒光配體（fluorescent ligands）
熒光配體是一類與金屬離子或其他分子特異性結合的分子，在結合后會產生熒光信號。熒光配體通常由以下幾個部分組成：
配位基團：與金屬離子或其他分子結合的官能團。
熒光基團：吸收光能并發(fā)出熒光的分子部分。
連接基團：連接配位基團和熒光基團的分子部分。
熒光成像中的挑戰(zhàn)和解決方案
小動物活體成像儀器在生物醫(yī)學研究中的應用日益廣泛，對熒光樣品進行成像時，有一些問題需要考慮，包括生物自發(fā)熒光、儀器性能、結果可靠性等。
1.穿透深度不足——選擇合適的熒光模塊/熒光標記
在生物組織內，光的傳播受到散射和吸收的限制，使得深層組織結構和過程的成像變得困難。妨礙了對體內病理變化的深入研究。
熒光產生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在小動物活體成像系統(tǒng)中具體體現(xiàn)為熒光光源和發(fā)射光濾光片兩個關鍵部件。
● 熒光光源
勤翔小動物活體成像系統(tǒng)支持LED和激光光源，覆蓋幾乎所有市面上的熒光基團。
近紅外 LED 光源能夠更深地穿透生物組織，從而提升成像深度。它的非侵入性特點減少了對樣本的影響，產生的背景干擾較少，有助于提高圖像的清晰度，提供更為準確的成像結果。
激光光源的高亮度和方向性允許光穿透更深的組織，實現(xiàn)深層成像，獲得小動物體內更深層的生物過程。激光可以針對特定的熒光團進行選擇性激發(fā)，從而實現(xiàn)特定生物過程的成像，例如上轉化成像。激光激發(fā)能夠產生高對比度圖像，非常適合于活體熒光激發(fā)。
● 發(fā)射光濾光片
發(fā)射濾光片允許熒光基團發(fā)射的特定波段的光通過。在熒光成像中用于精確選擇和增強特定波段的信號，通過適當?shù)耐高^率和截止特性，可以有效提高成像質量，減少背景干擾。
● 熒光染料
染料的亮度因其各自熒光色素的不同而變化，受激發(fā)系數(shù)和熒光量子產率的雙重影響。不同染料與同一蛋白質使用時可導致背景信號的變化（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。
FITC和DiR都是常見染料，用于標記蛋白質時，DiR的激發(fā)波長更長，能夠更深地穿透組織，成像結果更好。
2. 背景熒光過高-樣品準備和先進的算法校正
組織的自發(fā)熒光以及非特異性染料結合所產生的信號，會產生背景干擾。這些非特異信號會掩蓋實際的熒光信號，導致結果變得模糊不清，影響實驗的可靠性和準確性。
為了更好地控制背景熒光，研究人員開發(fā)了多種策略。包括選擇與自發(fā)熒光波長差異較大的熒光標記物，使用數(shù)學算法進行圖像處理等方法以減少影響。（Nicholas Billinton et al.，2001）
● 自發(fā)熒光
自發(fā)熒光來自于結構成分，從小分子到更大的結構。生物的自發(fā)熒光峰值位于500nm左右，主要由毛發(fā)、皮膚、肌肉、血紅蛋白等引起。使用近紅外光源激發(fā)小動物活體成像，可以避開這些自發(fā)熒光干擾，獲得更高的信噪比的圖像。
● 剔除毛發(fā)
未剃毛的C57BL/6小鼠皮下腫瘤的生物發(fā)光信號強度比植入到Albino B6或NMRI Nude小鼠上的相似腫瘤信號低。（Liesa-Marie Schreiber et al.，2019）
至少提前一天進行脫毛或剃毛，使用鋒利的刀片，沖洗脫毛或剃毛區(qū)域，并用無菌紗布輕輕擦拭，去除任何殘留物。
● 飼料熒光
如果需要進行消化道成像，至少提前一周使用無熒光飼料喂養(yǎng)動物，以避免苜蓿素的熒光干擾。（Yusuke et al., 2008）
3. 靈敏度不足——更高端的硬件
對于涉及低豐度分子或信號較弱的探針，活體成像的靈敏度常常顯得不足。這使得檢測目標分子信號變得極為困難，未能及時捕捉到關鍵的信號可能會導致研究結果的偏差。
提高成像系統(tǒng)靈敏度依賴于兩個關鍵組件：鏡頭和感光芯片。通過優(yōu)化這兩個組件，勤翔小動物成像系統(tǒng)成功提升靈敏度，提供更可靠、更精確的活體成像工具。
● 鏡頭
鏡頭光圈決定透光能力，勤翔小動物活體成像系統(tǒng)采用f/0.8大光圈鏡頭，相比常見的f/0.95鏡頭，透光能力提升30%，成像時間更短，獲得更清晰圖像。
● 感光芯片
感光芯片的性能也影響靈敏度，其理想特性包括更大感光面積、像素尺寸、量子效率，以及更低的暗電流和背景噪聲。這些特性協(xié)同提升信噪比，實現(xiàn)高質量成像。
4. 數(shù)據(jù)準確性問題——專業(yè)的采集分析軟件
圖像質量和數(shù)據(jù)準確性可能受到多種因素的干擾。這些問題不僅影響了圖像的清晰度，也可能導致誤判和數(shù)據(jù)分析上的錯誤，妨礙結論的可靠性。
勤翔小動物活體成像軟件集成了強大的專用成像和分析模塊。成像模塊支持實時預覽、全自動控制，確保圖像數(shù)據(jù)的完整性和一致性。分析模塊采用先進算法，支持背景扣除、圖像增強和定量分析單位p/s/cm²/sr，進一步提高了圖像數(shù)據(jù)的準確性。軟件通過直觀的界面將這些功能集成在一起，消除人為錯誤的可能性，確保了成像結果的高度可重復性。
5. 信息單一，信號不易定位——多維成像
傳統(tǒng)的熒光成像技術通常只能提供單一模態(tài)的信息，缺乏多維度的綜合表征。在精確定位信號源方面的明顯不足，限制了對生物系統(tǒng)復雜交互作用的全面理解。
熒光成像提供了功能成像，揭示了生物過程的動態(tài)變化，例如基因表達、細胞活動和代謝。X射線成像則能提供結構信息，展示解剖結構。
結論
通過利用熒光標記和成像系統(tǒng)，研究人員能夠可視化和量化小動物體內特定分子、細胞和組織的分布及其動態(tài)行為。為了確保數(shù)據(jù)的高質量，本文提供了一些解決方案，以提升實驗的信噪比、分辨率和特異性。
