"科研汪" 們一定都有各自的鼠崽子，Of Course，想當年，小 M 做實驗滴時候，動物房隔壁還專門設有個冰箱——放置鼠崽子的  尸體  Body! (向科研小鼠致敬)

言歸正傳~帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是繼阿爾茨海默病之后第二大最常見的退行性疾病，常發(fā)生于中老年群體。PD 是多個基因和環(huán)境因素相互作用的結果，發(fā)病機制復雜。主要包括：氧化應激、線粒體功能障礙、α-突觸核蛋白失衡、神經炎癥、腸道微生物紊亂 (圖 1)。

  圖 1. 帕金森病的發(fā)病機制^[1]。

約 10% 的 PD 病例是由基因突變引起的，采用基因突變的動物模型有利于了解 PD 的發(fā)病機制或進展，并找到潛在的治療靶點。

不過，基因模型的病理和行為表型通常與人類狀況有差異。例如，幾乎所有這些基因模型中都未發(fā)現多巴胺能神經元的顯著損失 (PD 的主要病理特征)[3]。

圖 2. 帕金森病的遺傳動物模型^[2]。

遺傳模型是根據人類疾病中發(fā)現的基因突變進行調整的，如 SNCA (α-synuclein), LRRK2, DJ-1, Parkin, PINK1 基因突變等。這些基因是多巴胺能神經元功能的重要信號通路的一部分。

神經毒素包括 6-OHDA、MPTP 和魚藤酮 (Rotenone)、百草枯 (Paraquat) 等。急性接觸神經毒素會通過破壞線粒體功能和/或增加氧化應激而導致運動障礙和黑質紋狀體多巴胺能細胞快速死亡，而長期服用神經毒素會誘發(fā)進行性模型，其中可能包括誘導 α-突觸核蛋白聚集體生成 (圖 3)。

圖 3. 神經毒素誘導模型的發(fā)病機制^[3]。

 

• MPTP：穿過血腦屏障，在神經膠質細胞中被 MAO-B 代謝為 MPP+，然后代謝為活性毒性化合物。MPP+ 隨后被多巴胺轉運蛋白吸收，通過抑制電子傳遞鏈的復合物 I 來損害線粒體呼吸，從而引起氧化應激和程序性細胞死亡分子途徑的激活。

• Paraquat 和 6-OHDA 容易通過多巴胺轉運蛋白穿過細胞膜，也可能通過靶向線粒體發(fā)揮毒性，隨后產生 ROS 和醌，導致黑質紋狀體多巴胺能神經元退化。
• Rotenone 具有極強的疏水性，容易穿透細胞膜，誘導 α‐突觸核蛋白聚集體的形成和線粒體損傷，隨后產生 ROS 和醌。

下面是小 M 為大家整理的 PD 神經毒素模型的方法、特點和應用，大家可以點贊收藏喔~

 

表 1. 神經毒素模型的方法、特點和應用^{[4][5][6][7][8]}。 

 

目前，MPTP 模型已成為最常用的模型。其是唯一已知的能夠在人類和猴子中引起與 PD 臨床表現相似的多巴胺能神經毒素。同時，MPTP 使用方便，不需要任何特殊設備 (例如立體定位框架)，也不需要像 6-OHDA 或魚藤酮那樣對活體動物進行手術。此外，MPTP 在全身給藥后會產生可靠且可重復的黑質紋狀體多巴胺能通路病變，而其他毒素通常不會出現這種情況[2]。

當然，在進行 MPTP 的造模時，也要注意鼠的選擇，注射方式，給藥方案等，提高造模成功率！

MPTP 的毒性作用會導致黑質紋狀體損傷，紋狀體多巴胺耗竭，黑質致密部 (SNpc) 和紋狀體末端酪氨酸羥化酶 (Tyrosine hydroxylase, TH) 陽性神經元減少 (圖 4)。
如何判斷造模成功？[9][10]：

•  黑質紋狀體損傷: 造模成功后黑質和紋狀體區(qū)域 TH 減少 (IHC, IF, WB 等方法都可以);

• 大腦神經遞質 DA, DOPAC, 5-HT, HVA 等減少 (可通過 HPLC 檢測);

• 黑質紋狀體小膠質細胞 (IBA1⁺ cells) 和星形膠質細胞 (GFAP⁺ cells) 激活, 黑質區(qū) α-syn 聚集體數量增加。

圖 4. MPTP 造模后腦內多巴胺含量變化及 TH 陽性神經元免疫組化染色^[2]。

A-C. 多巴胺 (DA) 及其主要代謝物 DOPAC 和 HVA 的含量變化。在第一次和最后一次 MPTP 注射（18 mg/kg, i.p. 分 4 次注射，間隔 2 小時）后 0.5-1.0 小時用藥物治療小鼠。藥物繼續(xù)使用 4 天。在最后一次 MPTP 給藥后 7 天殺死小鼠。收集大腦，HPLC 測定多巴胺和代謝物水平。D-F. 黑質致密部 (SNpc) 和紋狀體 TH 陽性神經元的免疫組化染色和定量。注射 MPTP 后第 7 天取腦染色，在注射鹽水的對照組中，SNpc 和紋狀體末端存在密集的 TH 陽性細胞體和纖維網絡。注射 MPTP 后，SNpc 和紋狀體中的 TH 含量急劇降低。

 

 

PD 小鼠模型的神經損傷評價是多層面、多指標并存的。運動技能、學習和記憶障礙等指標可以共同評估動物的運動能力、姿勢和協(xié)調性。

▐  Open Field Test 曠場試驗

500×500×300 mm 曠場，曠場底面被平均分為 16 個 4×4 個小方格。正上方架攝像頭，視野覆蓋整個曠場。將動物放置在正中央格，同時進行攝像和計時，時間為 5 min。

通過計算機示蹤分析系統(tǒng)分析實驗動物的水平活動 (中央格停留時間、穿過中央格的次數、梳毛次數) 和直立次數，能夠反映動物的焦慮情況。

圖 5. 小鼠曠場試驗示意圖^[11]。

 

▐  Rotarod test 轉棒試驗

將小鼠置于直徑為 3 cm 的旋轉桿上，轉速調整為 30 r/min。記錄小鼠從置于轉棒到掉落轉棒所經歷的時間，測定時間為 1 min，每次中間休息 1 min，連續(xù) 5 次，并記錄 1 min 內小鼠掉落次數，能夠反映動物的運動協(xié)調能力。
▐  Morris 水迷宮
水迷宮實驗是評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力的經典程序，由一個圓形水池、水下平臺以及一套圖像自動采集和處理系統(tǒng)組成。
通過觀測和記錄動物學會在水箱內游泳并找到水下平臺的耗時、游泳軌跡和搜索策略，分析和推斷動物的學習、記憶和空間認知等方面的能力。

圖 6. Morris 水迷宮示意圖^[12]。
 

▐  Pole test 爬桿測試

將一根 1 cm 粗、50 cm 長的木棒固定在實驗臺之上，用紗布繞棒包裹以防止小鼠攀爬滑動。將木棒豎直放置，將小鼠放置于木棒下方，計算小鼠到木棒上方并折返回到桿的底部的時間。每只小鼠完成 3 次，兩次實驗之間的間隔在 10 min 以上，取三次的平均時間作為最后結果。

 

▐  酪氨酸羥化酶 (TH)

酪氨酸羥化酶 (Tyrosine Hydroxylase, TH) 負責催化 L-酪氨酸羥化并以四氫生物蝶呤 (BH4) 為輔酶生成左旋多巴。作為介導多巴胺生物合成的關鍵限速步驟，PD 動物模型黑質中 TH 陽性多巴胺能神經元會顯著減少。

圖 7. 小鼠紋狀體 (Striatum) 和黑質 (SNpc) 中 TH 的免疫組化染色^[13]。 

▐  α-突觸核蛋白 (α-synuclein)

帕金森病典型的病理學特征為 α-synuclein 在中腦黑質-紋狀體區(qū)的異常聚集，造成多巴胺能神經元死亡。

圖 8. 大鼠模型中紋狀體內注射 α-syn-PFF 引起的突觸前和突觸后功能障礙^[14]。

左圖：在皮質區(qū)，注射 α-syn-PFFs 的大鼠檢測到了一致比例的 p-α-syn+神經元。自發(fā)突觸電流分析表明，背側紋狀體靶神經元中自發(fā)興奮性突觸后電流的頻率增加，從而導致高谷氨酸能活動狀態(tài)。

右圖：α-syn-PFF 大鼠的 SNpc 呈現多巴胺能神經元數量減少，表現為 TH+免疫熒光減少，與自發(fā)放電活動異常增加有關。中間圖：在背外側紋狀體中，注射 α-syn-PFFs 導致 SPN 中皮質紋狀體長期可塑性發(fā)生重大改變。還觀察到 TH+纖維顯著減少和 SNpc 終端內源性多巴胺釋放減少.

 

MCE 可提供高純度，生物活性經過驗證的 MPTP，產品已經過專業(yè)的生物驗證，更是得到全球客戶的認可。

實驗方案：

20 mg/kg 或 23.4 mg/kg，腹腔注射，每隔 2 h 注射一次，一天內打 4 次。12 周雄性 C57BL/6N 小鼠。給藥完 7 天后取材 (有文獻表明急性給藥后第7天黑質紋狀體損傷達到穩(wěn)定)[5]。

• 紋狀體 TH 平均清除率：60% (20 mg/kg)，79% (23.4 mg/kg)；

• 黑質致密部 (SNpc) TH 平均清除率：43% (20 mg/kg)，47% (23.4 mg/kg)。

   

 

圖 9. MCE MPTP 誘導小鼠帕金森病急性模型 TH 免疫組化染色。

A. 紋狀體，B. 黑質


萌家小貼士：

1. 造模小鼠不一定會出現帕金森病行為缺陷，小鼠個體差異性也較大,造模成功率一般難達 100%，因此在 MPTP 小鼠研究中要監(jiān)測的主要表型是與神經膠質增生相關的黑質紋狀體損傷，其程度取決于劑量和給藥方案[1][4][5]。

2. 造模后可能會死亡：一個常見問題是動物在開始給藥后的前 24 小時內急性死亡，雌性小鼠的死亡率較高。值得注意的是，急性死亡與大腦多巴胺能系統(tǒng)的損傷無關，有可能是由于外周心血管副作用。藥物劑量高/小鼠體重小于 22 g/不同批次藥物混用/小鼠沒有提前適應/動物房太冷均有可能會導致小鼠死亡，每組動物數目建議增大。

3. 注射后，肉眼可以注意觀察小鼠是否有活動性減弱、走路踉蹌，抽搐、炸毛，排尿變多等表現，這種行為可能可以持續(xù) 24-48 h，此后小鼠表現基本正常。

今天給大家盤點了帕金森的不同模型的發(fā)生機制、不同的造模方式以及行為學/病理學評價等，主要給大家介紹了如何用 MPTP 造模，大家可以根據自己的實驗需求選擇合適的造模方式。如需幫助，可聯系萌家線下銷售經理或者技術獲取技術支持，助您的實驗一臂之力~

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MPTP hydrochloride 透過血腦屏障的多巴胺神經毒素，可用于誘導帕金森綜合癥模型

6-OHDA 一種廣泛應用的神經毒素，可選擇性破壞多巴胺能神經元

Rotenone 線粒體電子傳遞鏈復合物 I 抑制劑

Tyrosine Hydroxylase Antibody 酪氨酸羥化酶抗體

alpha Synuclein Antibody (YA2073) α-突觸核蛋白抗體

[1] Jankovic J, et al. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Aug;91(8):795-808.

[2] Jackson-Lewis V, et al. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2007;2(1):141-51.

[3] Javier Blesa, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. Challenges in Parkinson's Disease. 2016.

[4] Konnova EA, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. In: Stoker TB, Greenland JC, editors. Parkinson’s Disease: Pathogenesis and Clinical Aspects [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2018 Dec 21. Chapter 5.

[5] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.

[6] Lee, et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(2):213-22.

[7] Chen HX, et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Dis. 2020 Apr 27;11(4):288.

[8] Ma XZ, et al. Gut microbiota-induced CXCL1 elevation triggers early neuroinflammation in the substantia nigra of Parkinsonian mice. Acta Pharmacol Sin. 2024 Jan;45(1):52-65.

[9] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.

[10] Sun MF, et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction and TLR4/TNF-α signaling pathway. Brain Behav Immun. 2018 May;70:48-60. 

[11] Kuniishi H, et al. Early deprivation increases high-leaning behavior, a novelanxiety-like behavior, in the open field test in rats. Neurosci Res. 2017 Oct;123:27-35.

[12] Pritchett D, et al. Searching for cognitive enhancement in the Morris water maze: better and worse performance in D-amino acid oxidase knockout (Dao(-/-)) mice. Eur J Neurosci. 2016 Apr;43(7):979-89.

[13] Lu Y, et al. Metabolic Disturbances in the Striatum and Substantia Nigra in the Onset and Progression of MPTP-Induced Parkinsonism Model. Front Neurosci. 2018 Feb 20;12:90.

[14] Calabresi P, et al. Alpha-synuclein in Parkinson's disease and other synucleinopathies: from overt neurodegeneration back to early synaptic dysfunction. Cell Death Dis. 2023 Mar 1;14(3):176.