免疫檢查點（Immune Checkpoint）是一類免疫抑制分子，免疫檢查點阻斷療法通過抑制程序性死亡受體及其配體結(jié)合,從而提高宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊性。尤其是免疫檢查點阻斷(ICB)抑制劑的發(fā)現(xiàn)，極大改善了癌癥患者的預(yù)后�；�于液體活檢的生物標志物體外診斷方法，可以使ICB治療盡可能延緩腫瘤的進展、延長患者生存期并提高患者生活質(zhì)量。與目前臨床基于化學發(fā)光和吸光度法的酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）相比，熒光免疫法（FIA）不依賴于酶活性或底物濃度，具有更好的靈敏度，然而熒光團的低量子產(chǎn)率，有限的光穩(wěn)定性和強自身熒光背景等因素制約，難以進一步被臨床廣泛應(yīng)用。近年納米技術(shù)的發(fā)展，促使具有表面等離子體共振的金屬納米結(jié)構(gòu)，可通過金屬熒光增強效應(yīng)（MEF）有效放大熒光信號，以達到高敏診斷，同時長波近紅外熒光(NIRF)具有較低的自身熒光干擾，明顯提高檢測結(jié)果的靈敏度和信噪比。因此，高靈敏度、高通量、能同時檢測多種生物標志物的體外診斷方法，對于推動腫瘤患者的診斷、治療和預(yù)后尤為重要。

近期，來自華南腫瘤國家重點實驗室，廣東省鼻咽癌診療重點實驗室以及中山大學腫瘤防治中心的楊江教授報道了一種基于生物傳感器，用于高敏檢測可溶性免疫檢查點預(yù)測分子sICAM-1（細胞間黏附分子-1）和sPD-L1（細胞程序性死亡-配體1）的文章，題目為“A near-infrared fluorescence-enhancing plasmonic biosensing microarray identifies soluble PD-L1 and ICAM-1 as predictive checkpoint biomarkers for cancer immunotherapy”于2023年8月發(fā)表在國際生物傳感器權(quán)威雜志Biosensors and Bioelectronics上。

該研究團隊合成了一種基于金納米島狀結(jié)構(gòu)（AuNIS）的增強近紅外熒光微陣列免疫分析 (eFMIA)生物傳感器，具有豐富的納米間隙，可將結(jié)構(gòu)對稱的IRDye78熒光分子的近紅外熒光放大200倍以上。此外，利用M2非接觸式壓電驅(qū)動的生物打印技術(shù)（該打印技術(shù)具有分辨率高、打印速度快、高生物活性、材料浪費低等優(yōu)勢），多項性能優(yōu)于傳統(tǒng)的FIA和ELISA。eFMIA能檢測腫瘤患者隊列中sICAM-1和sPD-L1的標志物差異水平，發(fā)現(xiàn)相較于部分緩解（PR）的病人隊列，疾病進展（PD）隊列中存在sPD-L1高表達，sICAM-1低表達（見圖1）。

圖1:NIF增強等離子體微陣列檢測示意圖

作者使用德國M2-Automation公司的iTWO-200非接觸式點樣儀進行多孔板微陣列制備，過程中使用壓電式皮升級PDMD噴頭，其具有良好的定位精度和點樣準確性，設(shè)置環(huán)境濕度為60%，溫度為25℃，體積為180 pL /滴，每個點重復(fù)5次，同時，液滴的大小和飛行軌跡使用集成的頻閃儀實時進行跟蹤。樣品點印在納米金結(jié)構(gòu)包被的孔板上，然后使用生物素標記（IRDye78）的抗體進行檢測，熒光強度使用AzureSpot軟件進行NIFR檢測以及液滴點印穩(wěn)定性分析（見圖2）。

圖2：非接觸式PDMD噴頭在AuNIS上制備具有NIRF增強的可控和可重復(fù)的微陣列(A)PDMD點印過程示意圖以及利用NIRF進行免疫檢測的工作原理 (B)不同條件下合成的Au結(jié)構(gòu)之間間隙距離的量化：SEM（掃描電子顯微鏡）、Binary（二進制圖像）(C)各種條件下合成的AuNIS歸一化間隙分布，使用gamma分布函數(shù)對直方圖進行擬合(D)累積分布概況。(E)非接觸式PDMD點印穩(wěn)定性評估 (n=10)，單位pl(F)噴點體積分布統(tǒng)計(G) 頭部質(zhì)控相機對點印的2 × 3陣列質(zhì)控圖(H)組內(nèi)及組間點間距統(tǒng)計(1)組內(nèi)及組間熒光強度統(tǒng)計(n=10)。(J)字母“SYSUCC”圖案的定制化點印陣列

為了進一步利用eFMIA檢測腫瘤相關(guān)的生物標志物，作者培養(yǎng)了兩種人鼻咽癌細胞系S26和C666-1，首先通過RT-qPCR對ICAM-1和編碼PD-L1的CD274 mRNA表達進行測定，發(fā)現(xiàn)在C666-1細胞中mRNA和蛋白表達均高于S26細胞。此外，ICAM-1和PD-L1在人血漿、血清以及PBS中無顯著差異。眾所周知，PD-L1在腫瘤細胞中以膜結(jié)合的形式抑制T細胞的免疫活性。為了檢測鼻咽癌細胞是否會釋放PD-L1，作者在C666-1細胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)分泌的PD-L1，且分泌水平隨時間和C666-1細胞數(shù)量的增加而增加。從臨床角度而言，識別低豐度或微量變化的生物標志物具有重大的臨床意義。因此，作者招募了28名接受抗PD -1 ICB治療的癌癥患者，在第一次給藥前1天采集血清進行eFMIA測定。結(jié)果顯示，治療前血清sPD-L1水平PD患者顯著高于PR患者(0.42 vs 0.18 ng /mL)，相反，PR患者血清sICAM-1水平高于對照組PD患者 (0.92 vs. 0.60 ng /mL)（見圖3）。

圖3：檢測鼻咽癌細胞和病人血清中的可溶性ICAM-1和PD-L1(A) 檢測兩種鼻咽癌細胞系S26和C666-1中ICAM1和CD274 mRNA的表達(B)鼻咽癌細胞中ICAM-1和PD-L1在S26和C666-1細胞系中的表達水平 (C) 1.6 nM ICAM-1和2.0 nM PD-L1的NIRF信號強度，PD-L1在PBS、20%人血漿和20%人血清中水平均增加(D)不同C666-1細胞對應(yīng)PD-L1的分泌水平，樣本來自接受抗pd -1 ICB治療的前癌癥患者(n=28)的血清(E) PD-L1和(F) ICAM-1水平檢測，根據(jù)內(nèi)參標準歸一化法進行NIRF相對平均強度計算

研究者基于金屬熒光增強MEF效應(yīng)，成功制備了可用于檢測腫瘤患者外周血液樣本中生物標志物的生物傳感器，具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、高通量的優(yōu)勢，能同時檢測多種標志物，且標志物之間相互干擾小�；�于此，該傳感器有望幫助臨床醫(yī)生決策和患者分層，來預(yù)測ICB治療的療效。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115633

M2-Automation成立于2003年，總部位于德國柏林，是一家創(chuàng)新技術(shù)開發(fā)公司，專注于微量/超微量、非接觸式自動化移液和生物芯片點樣技術(shù)。儀器準確性、精確性高，重復(fù)性好，全程自動化點樣，同時可根據(jù)客戶需求進行定制。

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