接上回，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類(lèi)分析中的機(jī)器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計(jì)方法綜述（一）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類(lèi)分析中的機(jī)器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計(jì)方法綜述（二）中，綜述了在過(guò)去幾年間發(fā)展起來(lái)的，用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析中聚類(lèi)的機(jī)器學(xué)習(xí)和統(tǒng)計(jì)方法，重點(diǎn)介紹了如何將一些常見(jiàn)的聚類(lèi)方法，如層次聚類(lèi)、基于圖的聚類(lèi)、混合模型、k-means、集成學(xué)習(xí)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和基于密度的聚類(lèi)等加以調(diào)整及應(yīng)用，從而解決單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中的獨(dú)特挑戰(zhàn)，例如低表達(dá)基因的缺失，轉(zhuǎn)錄本的不均勻覆蓋，以及由技術(shù)偏差和不相關(guān)的混雜生物變異所帶來(lái)的細(xì)胞標(biāo)記的失真。我們?cè)u(píng)價(jià)了標(biāo)準(zhǔn)化、dropouts推測(cè)以及降維等預(yù)處理步驟如何提高聚類(lèi)效果。

本文將繼續(xù)介紹一些能夠?qū)�時(shí)間序列樣本和多個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行聚類(lèi)并且檢測(cè)罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的新方法。最后，對(duì)部分開(kāi)發(fā)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類(lèi)分析的軟件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和比較，以評(píng)估其性能和效率，為未來(lái)的數(shù)據(jù)分析提供一定的指導(dǎo)和方向。

 

01 罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型及單個(gè)細(xì)胞類(lèi)群

在單細(xì)胞的聚類(lèi)分析中，罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的檢測(cè)是一個(gè)重要問(wèn)題，因?yàn)樵诎l(fā)育或疾病進(jìn)展中起重要作用的細(xì)胞類(lèi)型往往豐度較低。由于罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的群體規(guī)模小，在標(biāo)準(zhǔn)的聚類(lèi)分析中往往難以檢測(cè)到。

RaceID是專(zhuān)門(mén)用于從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識(shí)別稀有細(xì)胞類(lèi)型的一種聚類(lèi)工具。該工具首先計(jì)算細(xì)胞間Pearson相關(guān)性用于k-means聚類(lèi)。在每個(gè)類(lèi)群中，根據(jù)和背景噪聲模型相比的基因的變異型篩選離群細(xì)胞。最后，如果離群細(xì)胞的相關(guān)性超過(guò)原始聚類(lèi)中細(xì)胞間相關(guān)性的閾值，則將離群細(xì)胞合并到離群簇中。

GiniClust是另一個(gè)聚焦于罕見(jiàn)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的聚類(lèi)工具。在算法中使用基尼系數(shù)進(jìn)行特征基因的選擇。與常用的Fano因子相比，這種方法對(duì)細(xì)胞總量占比較低的細(xì)胞群體更加敏感。最后，利用基尼系數(shù)篩選得到的基因作為特征進(jìn)行DBSCAN密度聚類(lèi)，檢測(cè)稀有細(xì)胞類(lèi)型。

屬于稀有細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞也可以被視為聚類(lèi)過(guò)程中產(chǎn)生的異常值。在大多數(shù)已公開(kāi)的單細(xì)胞聚類(lèi)算法中，都可以生成數(shù)量相對(duì)較小的簇，甚至該簇中只包含一個(gè)細(xì)胞。雖然這可能是由于聚類(lèi)算法的初始化或收斂性差造成的，但它也可以被解釋為來(lái)自罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的異常細(xì)胞。一些算法或工具包含特定的技術(shù)和參數(shù)，能夠進(jìn)行罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的檢測(cè)。以使用層次聚類(lèi)的SINCERA為例，它不要求用戶指定簇之間的最小距離，而是使用允許的最低細(xì)胞數(shù)量的閾值。

 

02 細(xì)胞Marker基因的檢測(cè)

聚類(lèi)分析的另一個(gè)重要目的是發(fā)現(xiàn)新的Marker基因，以描述通過(guò)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)的每種細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)模式和功能，從而用于未來(lái)的生物學(xué)解釋和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。大多數(shù)方法是在聚類(lèi)后通過(guò)對(duì)不同類(lèi)群之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析來(lái)識(shí)別Marker。例如，Seurat使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，這是一種基于排序表達(dá)值中秩次統(tǒng)計(jì)量的非參數(shù)檢驗(yàn)方法。在SINCERA中，當(dāng)樣本容量較小，同樣使用秩和檢驗(yàn)，當(dāng)樣本容量變大時(shí)則使用Welch’s t檢驗(yàn)。

除了上述方法是將差異表達(dá)分析作為聚類(lèi)的后處理步驟，還有一些則是在聚類(lèi)的過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行Marker基因的檢測(cè)。BackSPIN計(jì)算每次分裂后每個(gè)簇中的平均基因表達(dá)量，并將每個(gè)基因分配到表達(dá)量最高的簇中。DendroSplit通過(guò)Welch’s t檢驗(yàn)識(shí)別p值最顯著的Marker基因作為類(lèi)群分離評(píng)分，以決定是否需要在層次聚類(lèi)中進(jìn)一步拆分分支。SAIC使用k-means對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)的同時(shí)，利用方差分析選擇Marker基因。

 

03 方法評(píng)估

在本節(jié)中，我們對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類(lèi)方法進(jìn)行了兩次實(shí)驗(yàn)評(píng)估。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們使用人外周血單細(xì)胞數(shù)據(jù)，比較了幾種廣泛使用的單細(xì)胞聚類(lèi)工具或方法，以確定不同方法的優(yōu)勢(shì)和局限性。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)來(lái)自5個(gè)個(gè)體的212個(gè)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了聚類(lèi)，以評(píng)估不同的工具在不同批次來(lái)源的多個(gè)細(xì)胞群中的聚類(lèi)性能。

 

● 人外周血數(shù)據(jù)  

我們從10x Genomics網(wǎng)站下載了PBMC數(shù)據(jù)，在原始數(shù)據(jù)中總共包含了103887個(gè)細(xì)胞。除了使用整個(gè)數(shù)據(jù)集去進(jìn)行方法的比較外，我們還對(duì)原始數(shù)據(jù)按照不同大�。�100，1000，10000）進(jìn)行向下采樣以評(píng)估其延展性。數(shù)據(jù)集最初包含32739個(gè)表達(dá)基因，我們從中選擇了至少在3個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的19630個(gè)基因。（使用的計(jì)算機(jī)參數(shù)：Intel Xeon E52687W v3 3.10GHz, 25 M Cache and 256 GB of RAM）。

Figure 5. PBMC中聚類(lèi)方法的比較

(A)Y軸表示ARI值，X軸表示不同的測(cè)試數(shù)據(jù)集。其中不同顏色代表了不同的工具或方法。(B)Y軸表示運(yùn)行時(shí)間，X軸同圖A。曲線截?cái)啾砻髟摲椒ㄔ谙鄳?yīng)數(shù)據(jù)集下不再適用。
 

如圖5所示，通過(guò)對(duì)10次不同的運(yùn)行結(jié)果取均值和標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)ARI和運(yùn)行時(shí)間進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在這些方法中，Monocle、cellTree、Seurat和SC3的表現(xiàn)最好。但是，由于內(nèi)存問(wèn)題，Monocle、cellTree和Seurat不能擴(kuò)展到所有的測(cè)試數(shù)據(jù)集。SC3的算法中，最多對(duì)5000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)，剩余的細(xì)胞則通過(guò)構(gòu)造一個(gè)支持向量機(jī)（SVM）完成。而除去這一監(jiān)督學(xué)習(xí)的步驟，SC3的表現(xiàn)和cellTree、Seurat相似。pcaReduce能夠應(yīng)用于所有的數(shù)據(jù)集，但運(yùn)行時(shí)間超過(guò)2天（圖5B），同時(shí)聚類(lèi)結(jié)果并沒(méi)有因?yàn)閿?shù)據(jù)集包含細(xì)胞數(shù)的增多而得到改善（圖5A）。SCRAT包在對(duì)100個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行聚類(lèi)時(shí)表現(xiàn)良好，但當(dāng)使用40個(gè)單元（此處單元表示具有相關(guān)基因表達(dá)的細(xì)胞）聚類(lèi)1000個(gè)細(xì)胞時(shí)變得不穩(wěn)定。此外，該工具至少需要3天時(shí)間來(lái)處理5000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集，因此不能擴(kuò)展到更大的數(shù)據(jù)集。

圖5A還顯示，SC3和pcaReduce等使用k-means作為聚類(lèi)步驟之一的工具在多次運(yùn)行中的方差最大，而使用層次聚類(lèi)的工具cellTree、CIDR和DendroSplit，使用基于圖聚類(lèi)方法的工具SNN-Cliq和基于密度的聚類(lèi)工具M(jìn)onocle在多次運(yùn)行中總是保持相同的聚類(lèi)結(jié)果�；旌夏Ｐ蚑SCAN和Seurat以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法SCRAT也返回相同的聚類(lèi)結(jié)果，這表明在聚類(lèi)實(shí)現(xiàn)的過(guò)程中使用了一些固定的初始化策略。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，基于層次聚類(lèi)的方法顯示出非常接近的平均ARI結(jié)果。當(dāng)聚類(lèi)1000個(gè)細(xì)胞時(shí)，我們可以看到BackSPIN、CIDR、DendroSplit和ICGS的ARI值大約在0.25到0.3之間。cellTree雖然也是基于層次聚類(lèi)，但應(yīng)用了LDA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，這似乎更適用于原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。在基于劃分的聚類(lèi)方法上，我們可以看到，盡管pcaReduce使用k-means作為其框架的一部分，但通過(guò)正確使用PCA和聚類(lèi)的合并策略，能夠顯著改善聚類(lèi)的結(jié)果。SC3看起來(lái)是一種前景不錯(cuò)的方法，它結(jié)合了幾種不同的距離測(cè)量和映射方法的優(yōu)點(diǎn)，然而，當(dāng)數(shù)據(jù)集增大，即SC3開(kāi)始依賴(lài)SVM對(duì)更多的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)時(shí)，結(jié)果似乎是不穩(wěn)定的，例如聚類(lèi)10000個(gè)細(xì)胞的結(jié)果要差于聚類(lèi)1000個(gè)細(xì)胞的結(jié)果。使用GMM的TSCAN在大數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出比k-means更好的結(jié)果，這表明高斯混合模型可能在聚類(lèi)中發(fā)揮更好地積極推動(dòng)作用。對(duì)于基于密度的聚類(lèi)，Monocle在聚類(lèi)10000個(gè)細(xì)胞時(shí)的性能優(yōu)于其他方法。最后，盡管Seurat和SNN-Cliq都建立了SNN作為聚類(lèi)的基礎(chǔ)，但是前者的總體表現(xiàn)更優(yōu)，可能是因?yàn)镾eurat使用了Louvain算法，而SNN-Cliq則是基于團(tuán)檢測(cè)的方法。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，即使有大量的專(zhuān)門(mén)為單細(xì)胞分析所開(kāi)發(fā)的聚類(lèi)方法，它們?cè)诰垲?lèi)數(shù)千個(gè)細(xì)胞時(shí)的結(jié)果顯示出相當(dāng)大的變化。并且我們?nèi)匀恍枰�一些方��，這些方法不像SC3那樣依賴(lài)于監(jiān)督學(xué)習(xí)，就能夠應(yīng)用于大型數(shù)據(jù)集，例如數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或者更多。

 

● 乳腺癌數(shù)據(jù)  

我們從公共數(shù)據(jù)中下載得到了來(lái)源于11名乳腺癌患者共515個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含了25636和基因的TPM表達(dá)值，我們從中提取了5000個(gè)高變基因進(jìn)行此次分析。這些細(xì)胞總體包含三類(lèi)：免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。由于一些患者的數(shù)據(jù)未覆蓋到全部三種類(lèi)型，因此，我們最后使用了來(lái)自5名患者的212個(gè)細(xì)胞作為此次實(shí)驗(yàn)的對(duì)象。

該數(shù)據(jù)集的主要目的是用于比較兩個(gè)適用于混合樣本聚類(lèi)的工具。首先，Seurat主要通過(guò)CCA的方法對(duì)來(lái)自不同患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合。運(yùn)行Seurat時(shí)，我們選取了幾個(gè)不同的參數(shù)：特征基因數(shù)量分別為{3000,3200,...,5000}，典型相關(guān)成分{2,...,10}，分辨率{0.2,0.3,0.4,0.5}。通過(guò)幾種不同的組合分析，我們最終發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)最優(yōu)的組合是1600+2+0.2，分別對(duì)應(yīng)上面三個(gè)參數(shù)。scVDMC在數(shù)學(xué)優(yōu)化框架中使用內(nèi)嵌的特征選擇來(lái)尋找一小組共享的基因以整合數(shù)據(jù)集。我們同樣選取不同的參數(shù)進(jìn)行組合，最后得到的最優(yōu)組合是λ = 1000，α = 3，w = 3。

Figure 6 BRCA中聚類(lèi)方法的比較

(A)Y軸表示ARI值，X軸表示不同工具和數(shù)據(jù)集的組合。(B)同圖A。

 

我們也將這兩個(gè)工具和上一節(jié)中表現(xiàn)最好的Monocle，SC3以及cellTree在兩個(gè)層面進(jìn)行了比較：按照樣本來(lái)源分離單獨(dú)進(jìn)行聚類(lèi)；合并樣本聚類(lèi)。圖2展示了比較的結(jié)果。從圖6A中我們可以看到，SC3和cellTree在合并聚類(lèi)的得分中要差很多，提示我們簡(jiǎn)單的合并樣本不適用于整合多個(gè)不同來(lái)源的單細(xì)胞數(shù)據(jù)。我們還注意到scVDMC和Seurat都獲得了較高的ARI。其中，scVDMC的平均值為0.681，Seurat的平均值為0.675。盡管scVDMC的均值更高，但其方差也比較大，與Seurat的差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.3511）。另外，scVDMC相較于Seurat擁有更少的運(yùn)行時(shí)間（p=2E-14）�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明對(duì)于混合的樣本使用內(nèi)置批次矯正方法（如包含CCA的Seurat）的工具更為有效。

 

04 討論

在過(guò)去的幾年里，專(zhuān)門(mén)用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的聚類(lèi)算法已經(jīng)有了實(shí)質(zhì)性的發(fā)展。這些算法旨在解決單細(xì)胞數(shù)據(jù)中固有的挑戰(zhàn)，例如細(xì)胞特異性偏差、dropouts和技術(shù)噪聲。一些用于解決特定情況（批次、罕見(jiàn)細(xì)胞、時(shí)間序列）的工具已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。此外，不同的方法也越來(lái)越關(guān)注數(shù)據(jù)的預(yù)處理，如標(biāo)準(zhǔn)化、降維和相似性度量等，這些方法有助于減少執(zhí)行聚類(lèi)前的技術(shù)差異�？傊�，這些計(jì)算方法的進(jìn)步為單細(xì)胞數(shù)據(jù)的聚類(lèi)分析提供了非常大的幫助。

我們也注意到，由于單細(xì)胞平臺(tái)的發(fā)展，細(xì)胞捕獲和測(cè)序的成本及時(shí)間也越來(lái)越低，捕獲的細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越高。因此，越來(lái)越多的研究更需要擴(kuò)展性良好的聚類(lèi)工具或方法，以便能夠在更大的數(shù)據(jù)集中進(jìn)行使用。而這一發(fā)展也為分析帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，大多數(shù)現(xiàn)有的工具都無(wú)法很好地應(yīng)用到數(shù)萬(wàn)個(gè)甚至更多的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，所以也限制了部分算法在未來(lái)研究中的適用性。

另一個(gè)現(xiàn)有方法的缺陷是關(guān)于數(shù)據(jù)的整合。如今，單細(xì)胞數(shù)據(jù)集仍然在不斷地快速增長(zhǎng)，這些開(kāi)放的大量數(shù)據(jù)將會(huì)使我們對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞標(biāo)記、表達(dá)模式等擁有更深的了解。此外，這些數(shù)據(jù)還有助于構(gòu)建大規(guī)模不同疾病隊(duì)列的單細(xì)胞圖譜。然而，目前的聚類(lèi)方法中，很少有專(zhuān)門(mén)應(yīng)用于多數(shù)據(jù)的合并聚類(lèi)分析，往往需要借助其它工具的使用。

除了本文中主要描述的無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法之外，還有一種使用監(jiān)督或半監(jiān)督學(xué)習(xí)方式來(lái)進(jìn)行細(xì)胞聚類(lèi)的替代方法。例如，SC3包使用監(jiān)督學(xué)習(xí)將多余的細(xì)胞分配給通過(guò)共識(shí)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)的簇，提高了其在大數(shù)據(jù)集應(yīng)用上的延展性。再比如，當(dāng)有一個(gè)已知類(lèi)別的參考數(shù)據(jù)集時(shí)，通過(guò)Scmap，可以將其他數(shù)據(jù)集中未知的細(xì)胞比對(duì)到該參考數(shù)據(jù)集中最相似的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的聚類(lèi)。

最后，除了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)之外，更多不同類(lèi)型的單細(xì)胞組學(xué)方法也呈現(xiàn)風(fēng)靡之勢(shì)。盡管面對(duì)新類(lèi)型的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，現(xiàn)有的方法仍然部分適用。但是在未來(lái)，也迫切需要應(yīng)對(duì)多組學(xué)整合聚類(lèi)的新的計(jì)算方法。

 

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