受體相互作用蛋白1（RIP1）激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其 C 端含死亡結構域，通過自身相互結合或與其它含死亡結構域的分子（如 TRADD、Fas、TNFRI）結合，參與 TNF、FasL 刺激后的信號轉導，介導 NF-κB 活化，并誘導細胞凋亡，其功能受泛素化、鋅指蛋白及熱休克蛋白等的調(diào)節(jié)。研究表明^[1,2]，RIP1 激酶的活化與缺血性損傷、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關。Yoshikawa 等^[3]，以 RIP1 為靶點，設計 RIP1 激酶抑制劑用于治療自身免疫性腦脊髓炎等神經(jīng)退行性疾病。

Yoshikawa 等，首先構建了 TR-FRET 體外篩選平臺，然后運用該方法對課題組已有的化合物庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑衍生物 10，其 pKi 值為 7.20。隨后將其與已報道的 RIP1 抑制劑 6 進行分子融合，設計了化合物 11，其擁有全新的母核結構和中等活性的 RIP1 抑制活性。研究表明，化合物 6 可以被 p 糖蛋白外排，進而導致較差的血腦屏障通透性。但是，化合物 11 卻擁有較低的p 糖蛋白外排率，這也許是因為其極性表面積減小，氫鍵供體數(shù)量減少的原因。隨后以 11 為先導化合物對母核進行替換，期望能夠在保持其優(yōu)異理化性質(zhì)的同時，提高化合物的活性（圖1）。經(jīng)過一系列的結構改造，結果如圖 2 所示，化合物 14 擁有最強的活性（pKi＝8.41）和 較低的 p 糖蛋白外排率（ER=0.7）。

圖 1. 化合物 6、10 和 11 的結構式（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

圖2. 化合物母核的改造（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

為了更好的研究化合物 14 與靶蛋白的作用模式，研究人員進行了分子對接，結果如圖 3 所示。根據(jù)對接結果進行結構改造：1）分子中的芐基伸入疏水變構調(diào)節(jié)口袋，該口袋位于 ATP 結合口袋的背面，主要由親脂性氨基酸殘基 Leu129 和 Val134 的側鏈組成，因此可以在苯環(huán)上引入合適的取代基來探討活性的變化，也可以在苯環(huán)上增加與 Ser161 的氫鍵相互作用（R1）；2）吡唑環(huán)的 3 位周圍存在一個較小的疏水口袋，在該處引入取代基來探討口袋的大�。≧2）；3）通過在化合物左側苯環(huán)的間位和對位引入取代基（R3）改善化合物的 ADMET 性質(zhì)。經(jīng)過一系列的結構優(yōu)化，作者得到了候選化合物 22，其 pKi 值為 9.04，ER 值為 0.6，在人和小鼠肝微粒體中的清除率均小于 1 μL/min/mg，小鼠口服生物利用度為 52.2%。晶體結構復合物也闡明了其與靶蛋白的確切作用模式。（圖4）

圖 3.（A－B）化合物 14 與 RIP1 蛋白的分子對接圖；（C）化合物的設計及化合物 22 的分子結構式（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

圖 4.化合物 22 與 RIP1 蛋白的共晶復合物（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

      鑒于化合物 22 優(yōu)異的體外活性和藥代動力學性質(zhì)，隨后進行體內(nèi)藥效實驗�？诜�給藥 26 天，每天監(jiān)測實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎模型（EAE）小鼠的臨床癥狀�？瞻讓φ战M小鼠在第 12 天開始出現(xiàn) EAE 臨床癥狀，并在 21 天左右達到頂峰；與之對應的給藥組可以減弱 EAE 臨床癥狀。這一結果表明，化合物 22 可以預防 EAE 模型的疾病進展。（圖5）

圖 5. 評價化合物 22 在 EAE 模型中的效果

小M 的小思考：

RIP1 作為細胞凋亡的關鍵調(diào)節(jié)蛋白，自從其被發(fā)現(xiàn)以來就備受關注。其不僅參與促細胞存活的信號傳導，還參與多種途徑的細胞程序性死亡信號傳導，與多種疾病如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病密切相關。該靶點的抑制劑 GSK2982772 目前正在進行炎癥性疾病的臨床研究，如潰瘍性結腸炎、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病等。然而，針對神經(jīng)退行性疾病尚未有抑制劑進入臨床研究，其原因主要是因為抑制劑較低的口服生物利用度和較差的腦通透性。本研究通過高通量篩選和基于結構的藥物設計，發(fā)現(xiàn)了活性高、藥代動力學性質(zhì)優(yōu)、p 糖蛋白外排率低的新穎候選化合物 22。該化合物在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎模型（EAE）小鼠上表現(xiàn)出明顯的療效，具有重要的應用價值。

Reference：

[1] Wegner, K. W.; et al. Complex pathologic roles of RIPK1 and RIPK3: movingbeyond necroptosis. Trends Pharmacol.Sci. 2017, 38, 202−225.

[2] Shao, L.; et al. The contribution of necroptosis in neurodegenerative diseases.Neurochem. Res. 2017, 42, 2117−2126.

[3] Yoshikawa, M.; et al. Discovery of 7‐Oxo-2,4,5,7-tetrahydro‐6Hpyrazolo[3,4‐c]pyridineDerivatives as Potent, Orally Available, and Brain Penetrating ReceptorInteracting Protein 1 (RIP1) Kinase Inhibitors: Analysis of Structure−KineticRelationships. J. Med. Chem. 2018, 61,2384−2409.

相關產(chǎn)品：

GSK2982772

GSK2982772 是有效，ATP 競爭型的 RIP1 抑制劑，IC₅₀ 值為16 nM。

Necrostatin-1

Necrostatin-1 是 RIP1 激酶抑制劑，作用于 Jurkat 細胞，抑制程序性壞死，EC₅₀ 為490 nM。

GSK'481

GSK'481 能夠在 HEK293T 細胞中抑制 RIP1 WTS166 的磷酸化。